Ein verminderter Fluss des linken Herzens bei fötalen Lämmern führt zu einer Hypoplasie des linken Herzens und Pro

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 770 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Als Ursache für das hypoplastische Linksherzsyndrom (HLHS) wird häufig ein geringer Blutfluss durch das linke Herz des Fötus vermutet. Um zu untersuchen, ob eine Abnahme des linken Herzflusses zu Wachstumsstörungen führt, erzeugen wir bei fötalen Lämmern in der mittleren Schwangerschaftsdauer eine Obstruktion des linksventrikulären Zuflusses (LVIO), indem wir mithilfe einer ultraschallgeführten perkutanen Technik Spulen in ihren linken Vorhof implantieren. Signifikanter LVIO fasst wichtige klinische Merkmale von HLHS zusammen: verminderter antegrader Aortenklappenfluss, kompensatorische retrograde Perfusion des Gehirns und der aufsteigenden Aorta (AAo) aus dem Arteriengang, schwere Hypoplasie des linken Herzens, ein nicht apexbildender LV und eine verdickte endokardiale Schicht. Die hypoplastischen AAo verfügen über miRNA-Genpaare, die die Zellproliferation annotieren und durch Bulk-RNA-Seq umgekehrt unterschiedlich exprimiert werden. Einzelkern-RNA-Seq des hypoplastischen LV-Myokards zeigt eine Zunahme der Fibroblasten mit einer reziproken Abnahme der Anteile der Kardiomyozytenkerne. Fibroblasten, Kardiomyozyten und Endothelzellen aus hypoplastischem Myokard weisen eine erhöhte Expression von extrazellulären Matrixkomponenten oder Fibrosegenen mit fehlregulierter Signalübertragung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors auf. Daher reicht eine starke anhaltende (~ 1/3 Schwangerschaft) Verringerung des fetalen Linksherzflusses aus, um eine Linksherzhypoplasie zu verursachen. Dies geht mit Veränderungen in der Zellzusammensetzung und Genexpression einher, die mit einer profibrotischen Umgebung und einer fehlerhaften Induktion mesenchymaler Programme einhergehen.

Die linksventrikuläre (LV) Hypoplasie ist ein Bestandteil vieler Formen angeborener Herzfehler. In der schwersten Form, dem hypoplastischen Linksherzsyndrom (HLHS), sind alle Strukturen des linken Herzens verkleinert und können den systemischen Kreislauf nicht unterstützen. Trotz rekonstruktiver Chirurgie sind die klinischen Ergebnisse bei HLHS nicht optimal: Überlebensrate von 64 % oder 74 % nach 1 Jahr1 und 59 % oder 64 % nach 6 Jahren2, abhängig von der Art der Operation. Nur etwa 50 % der Patienten mit HLHS erreichen das 18. Lebensjahr und sind im frühen Erwachsenenalter mit mehreren Herausforderungen konfrontiert, einschließlich Herzversagen3.

Die Ätiologie der LV-Hypoplasie bleibt ungewiss und dürfte heterogen sein. Bei einigen Feten kann nach Abschluss der Kardiogenese eine LV-Hypoplasie auftreten, die durch den Verschluss des Ventrikelseptums in der 9,1. Schwangerschaftswoche beim Menschen gekennzeichnet ist (Carnegie-Stadium 22). Im spezifischen Kontext von HLHS wird ein nach der Kardiogenese beginnendes LV-Wachstumsversagen durch die Beobachtung gestützt, dass ein intaktes Ventrikelseptum im häufigsten anatomischen Muster von HLHS (Stenose oder Atresie der Aorten- und/oder Mitralklappe) zu finden ist4. 5,6 und dass das Fortschreiten einer schweren fetalen Aortenstenose zu HLHS im zweiten oder dritten Schwangerschaftstrimester wiederholt dokumentiert wurde7. Die hämodynamische Konsequenz des Verschlusses des Ventrikelseptums besteht darin, dass die fetale LV-Füllung prekärer wird: Sie hängt vollständig vom Fluss über die linke Atrioventrikularklappe ab und kann nicht mehr durch den Fluss über das Ventrikelseptum kompensiert werden.

Es wurde angenommen, dass hämodynamische Kräfte eine Rolle bei der Ätiologie von HLHS spielen, und Tiermodelle haben gezeigt, dass der Blutfluss die Entwicklung und das Wachstum kardiovaskulärer Strukturen beeinflusst. Eine 70-prozentige Abnahme des Blutflusses in der Halsschlagader von Kaninchen über einen Zeitraum von zwei Wochen führte zu einer endothelabhängigen Verringerung des Durchmessers, die einer Vasodilatation resistent war8. Bei Zebrafischembryonen hatte eine Obstruktion des ventrikulären Ein- oder Ausflusses tiefgreifende Auswirkungen auf die Herzmorphogenese, einschließlich der Klappenbildung und Kammerdifferenzierung; Ein distales Wachstumsversagen wurde auf geringere Scherkräfte auf Endokardzellen zurückgeführt9. Bei frühen Hühnerembryonen führte die einseitige Unterbindung der Vitellinvene zu strukturellen Missbildungen der Rachenbogenarterien und des Herzens10,11,12. Der resultierende Herzfehler, am häufigsten eine Anomalie des Ventrikelseptums oder der Semilunarklappen, hing vom Ausmaß der Flussreduzierung ab13. Bei älteren Hühnerembryonen nach der Kardiogenese führte eine Behinderung des Zuflusses des linken Herzens zu einem verminderten Herzwachstum14.

Bei Menschen und anderen Säugetieren ist die Myozytenproliferation15,16,17,18 die Grundlage für das Herzwachstum des Fötus, wobei der Mitoseindex vor der Geburt abnimmt19. Nach derzeitigem Kenntnisstand verlangsamt sich die Kardiomyozytenproliferation nach der Geburt weiter und im Erwachsenenalter beträgt der Umsatz weniger als 1 % pro Jahr des Gesamtpools20,21. Daher erfolgt das postnatale Herzwachstum hauptsächlich durch eine Zunahme des Volumens einzelner Kardiomyozyten (Hypertrophie) und eine Proliferation von interstitiellem Gewebe20. Die Quantifizierung der zellulären Zusammensetzung des Herzens aus Gewebeschnitten erfordert Stereologie15,17 oder Dispersion des Herzens, gefolgt von neuartigen Durchflusszytometrieprotokollen22 (Tabelle S1). Kardiomyozyten sind aufgrund ihrer Morphologie, Größe, Vielkernbildung und dem Fehlen nuklearer Marker23 besonders schwer zu quantifizieren. Die Transkriptomik einzelner Zellen (oder einzelner Kerne) ist eine leistungsstarke Methode zur Untersuchung komplexer Gewebe auf Einzelzellebene und hat beispiellose Einblicke in die Zellzusammensetzung sich entwickelnder Herzen ermöglicht24,25. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung an induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) von Patienten mit HLHS ergab eine abnormale endokardiale Signalübertragung26 und intrinsische Kardiomyozyten-Differenzierungs- und Reifungsdefekte27.

Im Jahr 1978 wurde ein fötales Säugetiermodell für HLHS unter Verwendung der LV-Einfluss- oder -Ausflussobstruktion vorgeschlagen28. Die LV-Einflussobstruktion (LVIO) bei fötalen Lämmern führte innerhalb von 2–7 Tagen zum frühen Tod, wobei das Verhältnis von links- zu rechtsventrikulär um 17 % abnahm ( RV) Gewicht28. Supravalvares Aortenbanding wurde bei diesen fötalen Lämmern besser vertragen als LVIO, und Autopsiemessungen ließen auf eine LV-Hypoplasie schließen28. In neueren Studien, die Echokardiographie verwendeten, führte das supravalvare Aortenbanding bei fötalen Lämmern nicht durchgängig zu einer Hypoplasie des linken Herzens, sondern stattdessen zu einer LV-Hypertrophie/-Dilatation29. Bisher waren Versuche, fötale Lammmodelle von HLHS zu erstellen, technisch anspruchsvoll.

Um die Pathogenese der Wachstumsstörung des linken Herzens bei einem großen Säugetier zu untersuchen, verringerten wir den Fluss des linken Herzens, indem wir ein fötales Lammmodell der Mitralstenose erstellten, das bei 0,52 begann und bei 0,84 endete. Von der 0,51 bis 0,97 Trächtigkeit steigt die Anzahl der Kardiomyozyten in der freien LV-Wand des fötalen Lamms ungefähr linear von 0,6 auf 2,4 × 109 Zellen30. Es wird geschätzt, dass zwischen der 0,75- und 0,84-Schwangerschaft 5–10 % der Kardiomyozyten im Zellzyklus aktiv sind, was zu einem Anstieg der Kardiomyozytenzahl um 30 % führt31. Daher untersucht unser Modell der fetalen Mitralstenose die Auswirkung einer Verringerung des linken Herzflusses während einer Phase des Herzwachstums durch Hyperplasie. Mithilfe der Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) untersuchten wir die Zusammensetzung des Zelltyps, Rückschlüsse auf die Abstammung und die unterschiedliche Genexpression im hypoplastischen LV-Myokard.

Erste Versuche, den linken Herzfluss durch Füllen des fötalen LV mit Spulen (n = 11) zu verringern, waren erfolglos, da die Lämmer entweder akut starben oder eine durch Spulen verursachte ventrikuläre Tachykardie die Implantation einer ausreichenden Anzahl von Spulen verhinderte, um den linken Herzfluss zu verringern. Dies geschah trotz des unterschiedlichen Gestationsalters (65–121 Tage) bei der Implantation, des Spulendurchmessers und des Wegs des Nadeleintritts in den LV: direkt durch die LV-Wand oder Eintritt durch das Lumen der Mitralklappe vom linken Vorhof (LA). Da der Eintritt in das Herz durch den LA besser toleriert wurde, führten wir eine größere Anzahl von Spulen nur in den LA ein und beobachteten am Tag 121 eine akute Unterfüllung des LV bei einem Fötus, der innerhalb einer Woche verstarb. Nachdem eine akute Wirkung beobachtet wurde, wurde der Ansatz, die Spulen vollständig innerhalb der LA einzusetzen, in einem jüngeren Alter (n = 2, 97 Tage) wiederholt: Dies wurde toleriert und am Tag 130 hatte ein Fötus einen retrograden Fluss in der AAo, eine hypoplastische AAo im Vergleich zum PA und ein unterfülltes, aber normal großes, apexbildendes LV. Dies ermutigte uns, die Spulenimplantation im LA noch früher zu versuchen (~76 Tage, 0,52 Schwangerschaftswochen) und mit der Möglichkeit einer längeren Dauer des niedrigen linken Herzflusses (bis ~124 Tage, 0,84 Schwangerschaftswochen; Abb. 1a). Diese fötalen Lämmer sind Gegenstand dieses Berichts.

a Überblick über die Studie: Spulenimplantation nach ca. 76 Tagen (0,52 Schwangerschaftswochen) und erneute Beurteilung ca. 48 Tage später. Die fetale Echokardiographie und die Gewebeentnahme für Histologie, Masse und snRNA-Sequenz wurden nach ca. 124 Tagen (0,84 Schwangerschaftstage) durchgeführt. b Es wurden 47 fötale Lämmer untersucht. Dreizehn Kontrollen hatten keine Intervention (n = 12 überlebten). Bei 34 fötalen Lämmern wurden Spiralen implantiert, und 15 überlebten die Trächtigkeit 0,84: Fünf hatten einen normalen Aortenklappenfluss und ein normales linkes Herz, neun Feten hatten einen verminderten Aortenklappenfluss mit kompensatorischem retrograden Fluss in der aufsteigenden Aorta und hatten eine Hypoplasie des linken Herzens entwickelt (nicht). -Apex, der in vier die linken Ventrikel bildet). Ein fetaler Hydrops war bei einem Fötus eine Folge einer spuleninduzierten schweren Mitralinsuffizienz. Der verstorbene Kontrollfötus war der Zwilling eines Lammes, das Spiralen erhalten hatte. AAo aufsteigende Aorta, LV linker Ventrikel, PA Lungenarterie, RV rechter Ventrikel.

Es wurden 47 Lämmer von 24 Mutterschafen verwendet (6 Einlings-, 13 Zwillings- und 5 Drillingsschwangerschaften): 34 Feten hatten nach 76 (IQR: 75, 80) Tagen bzw. 0,52 (IQR: 0,51, 0,54) Trächtigkeitstagen noch Vorhofspulen implantiert. und 13 waren nicht instrumentierte Kontrollen (Abb. 1b und Tabelle S2). Neunzehn von 34 (56 %) gewundenen Feten starben infolge der Instrumentierung und einer akuten Kreislaufveränderung. Zwölf (92 %) Kontrollen und fünfzehn (44 %) gewundene Feten überlebten die 46 (IQR: 45, 48) Tage oder 0,31 (IQR: 0,31, 0,33) Schwangerschaftstage bis zur echokardiographischen Beurteilung nach 124 (IQR: 123, 125) Tagen oder 0,84 (IQR: 0,84, 0,85) Schwangerschaft (Abb. 2a, b und S1). Einer der 15 überlebenden Coiled-Feten war stark hydropisch (Fötusgewicht 10 kg), Folge der Coil-induzierten schweren Mitralinsuffizienz und wurde nicht in weitere Analysen einbezogen.

Echokardiographische Vierkammeransicht eines Kontroll- (a) und eines hypoplastischen linken Ventrikels (b). c Retrograder Fluss in der aufsteigenden Aorta. d–g Freigelegte Herzen nach einer Sternotomie. d Kontrolle, wobei der linke Ventrikel den Apex bildet; e Mittlere Hypoplasie des linken Herzens, bei der beide Ventrikel die Spitze bilden; f Schwere Hypoplasie des linken Herzens, wobei der rechte Ventrikel die Spitze bildet; g Mittlere Hypoplasie des linken Herzens mit hypoplastischem AAo. h Linker Vorhof von oben, wobei Gewebe in die Windungen hineinwächst und diese bedeckt, was in unserem Modell der Mitralstenose zu einer Behinderung des linksventrikulären Zuflusses führt. i Stark hypoplastischer linker Ventrikel, freie Wand des linken Ventrikels geöffnet. AAo aufsteigende Aorta, LV linker Ventrikel, PA Lungenarterie, RV rechter Ventrikel.

Bei den verbleibenden 14 gewundenen Feten wurde der Schweregrad der LVIO anhand des Vorhandenseins eines retrograden Flusses über die aufsteigende Aorta32 beurteilt, der den mangelhaften antegraden Fluss über die Aortenklappe kompensierte (Abb. 2c und S1). Feten mit (i) keinem/minimalem LVIO hatten einen normalen antegraden Fluss über die Aortenklappe und keinen retrograden Fluss im AAo (n = 5), während Feten mit (ii) LVIO einen retrograden Fluss im AAo hatten (n = 9; Abb. 2c). Fünf der Feten mit retrogradem Fluss in der AAo hatten eine mittlere LVIO mit etwas verbleibendem Aortenklappenfluss, und vier hatten einen schweren LVIO ohne antegraden Aortenklappenfluss und nur eine retrograde Perfusion des Gehirns und der Koronararterien aus dem Arteriengang.

Echokardiographie und Autopsie bestätigten, dass die fünf Coiled-Herzen mit normalem antegraden Fluss über die Aortenklappe entweder nur sehr wenige oder keine Coils im linken Vorhof hatten (wahrscheinlich aufgrund einer frühen Coil-Embolisierung aus dem Herzen) oder dass die Coils weit von der Mitralklappe entfernt lagen im hinteren linken Vorhof/linken Vorhofohr und erzeugte keinen LVIO. Alle neun Feten mit LVIO zeigten ein LV-Wachstumsversagen. Herzen mit dem schwersten LVIO (n = 4) hatten eine Hypoplasie des linken Herzens, einschließlich nicht apexbildender LVs (Abb. 2f). Diejenigen mit mittlerem LVIO-Grad (n = 5) hatten kleine linke Herzen, aber mit weniger schwerwiegenden Wachstumsstörungen, z. B. teilte sich der LV immer noch die Spitze mit dem RV (Abb. 2e).

Bei den Spiral- und Kontrollfeten handelte es sich um Einzel- bis Drillingsschwangerschaften, was zu erheblichen Größenunterschieden führte. Ihr Gewicht lag zwischen 1,74 und 5,12 kg (Kontrollen: 3,0 ± 0,78 kg, gewickelt mit retrogradem AAo-Fluss: 3,28 ± 0,68 kg; p = 0,39; Tabelle S2), ausgenommen der hydropische Fötus. Aufgrund des großen fetalen Größenbereichs wurden die Messungen des linken Herzens auf die entsprechenden Strukturen des rechten Herzens oder das Gesamtherzgewicht normalisiert. Gewicht der freien LV-Wand (–39 % Mittelwert), LV-enddiastolische Abmessungen (Durchmesser: –52 % Mittelwert; Länge: –29 % Mittelwert) und Durchmesser der Aortenklappe (–38 % Mittelwert) und AAo (–30 % Mittelwert). Mittelwert) waren in den Low-Flow-LVs im Vergleich zu den Kontrollen signifikant reduziert (Tabelle 1). Unser Modell zeigte ein flussabhängiges Wachstumsversagen des fetalen linken Herzens, das die Merkmale des menschlichen HLHS rekapitulierte, einschließlich der retrograden Perfusion des Gehirns und der Koronararterien aus dem Arteriengang.

In den hypoplastischen LVs variierte im Vergleich zu den Kontrollen die Dicke der endo-/subendokardialen Schicht, war jedoch durchgehend dicker (p = 0,015) und wies in elastischen Trichrom-gefärbten Schnitten deutliche Purkinje-Fasern auf (Abb. 3, S2 und S3). Die subendokardiale Schicht des Myokards von hypoplastischen LVs war weniger dicht gepackt und Ödeme könnten zur Verdickung beigetragen haben. Bei der Untersuchung durch einen klinischen Pathologen und der Bestätigung durch Picro-Sirius-Rotfärbung gab es keine Hinweise auf endokardiale Elastose, Entzündung oder erhöhte Fibrose im Myokard aus den hypoplastischen LVs. Es gab jedoch verschiedene Regionen mit erhöhter subendokardialer Bindegewebsfärbung in gewickeltem Gewebe (Abb. 3 und S4). Apoptose wurde gemäß TUNEL-Assays weder in hypoplastischen Ventrikeln noch in Kontrollventrikeln gefunden (Abb. S5).

Das dickere Endokard hypoplastischer linker Ventrikel weist eine erhöhte Kollagenfärbung auf (a, b, blau; c, d, rot). Elastische Trichromfärbung: eine Kontrolle; b Schwere Hypoplasie des linken Herzens. Picro-Sirius-Rot-Färbung: c-Kontrolle; d schwere Hypoplasie des linken Herzens.

Wir haben die Massen-RNA-Sequenzierung hauptsächlich durchgeführt, um eine De-novo-Annotation des O. aries-Transkriptoms zu ermöglichen und so die Kartierung und Annotation der snRNA-seq-Daten zu verbessern. Wir untersuchten auch die unterschiedliche mRNA- und miRNA-Expression in AAo (n = 4 hypoplastisch, n = 2 Kontrollen) und LV (n = 4 hypoplastisch, n = 4 Kontrollen). Wir beobachteten eine hohe Korrelation zwischen biologischen Replikaten (Proben aus demselben Gewebe und Zustand; >0,88 für AAo und >0,91 für LV). Wir haben auch Unterschiede zwischen den Proben festgestellt, die bei einigen Proben die Auswirkungen des Coiling überwiegen können (Abb. S6) und möglicherweise mit einigen Proben mit niedrigen RNA-Integritätszahlen (RIN) zusammenhängen. Nachdem wir Ausreißer entfernt hatten, identifizierten wir 64 signifikant hochregulierte und 85 herunterregulierte Gene in AAo (Abbildung S7a; Hochregulierung bezieht sich auf eine höhere Expression bei gewundenen Feten). Pathway-Analysen signifikant unterschiedlich exprimierter Gene ergaben eine Anreicherung zellulärer Komponenten der Zellperipherie (p = 0,022) und der Plasmamembran (p = 0,029; Ergänzende Daten 1). Zusätzlich haben wir 4 hochregulierte miRNAs in AAo identifiziert (Abb. S8a). Für drei dieser miRNAs fanden wir deutlich herunterregulierte Zielgene (Abb. S8b), einschließlich Gene, die am Zellwachstum und der Zellproliferation (DDIT4, HS6ST2) und Zelladhäsion (NRXN3, IGFS3, HS6ST2) beteiligt sind. Für das LV entdeckten wir 4 signifikant hochregulierte und 13 herunterregulierte Gene (Abb. S7b), die für Differenzierungsprozesse brauner Fettzellen angereichert sind. Wir identifizierten außerdem 4 hochregulierte und 7 herunterregulierte miRNAs (Abb. S9a). Zu den am stärksten hochregulierten miRNAs gehörte miR-15a-5p. Bei Mäusen war die Überexpression von Mitgliedern der miR-15-Familie mit einem Rückzug des Kardiomyozyten-Zellzyklus und einer geringeren Herzgröße verbunden33. Zwei hochregulierte miRNAs hatten deutlich herunterregulierte Zielgene und drei herunterregulierte miRNAs hatten deutlich hochregulierte Zielgene (Abb. S9b). Zusätzliche „neue“ miRNAs in AAo und LV konnten nicht mit ihren jeweiligen Orthologen abgeglichen werden und wurden daher nicht bewertet. Während die niedrigen RIN-Werte vorsichtige Interpretationen erfordern, fanden wir unterschiedlich exprimierte miRNAs und Zielgene, die mit Zellwachstum, -proliferation und -adhäsion assoziiert sind. Allerdings konnten wir die Veränderungen nicht bestimmten Zelltypen oder biologischen Signalwegen zuordnen.

Um Veränderungen in der Zellzusammensetzung des Myokards und der zelltypspezifischen differentiellen Genexpression weiter zu bewerten, führten wir eine snRNA-Seq an LV-Freiwandproben durch. Wir haben 17.245 Kerne von gewundenen, stark hypoplastischen linken Herzen (n = 4 Feten mit keinem oder minimalem Fluss durch die Aortenklappe und ohne Mitralinsuffizienz) und 12.992 Kerne von Kontrollen (n = 3 nicht instrumentierte Feten; Abb. S10) erfasst. Wir identifizierten drei Cluster von Kardiomyozyten (0, 3, 10), zwei Cluster von Fibroblasten (1, 2), einen Cluster von glatten Muskelzellen (6), zwei Cluster von Endothelzellen (5, 15) und einen Cluster von lymphatischen Endothelzellen Zellen (12), zwei Cluster von Adipozyten (8, 9), zwei Cluster von Leukozyten (4, 11) und ein Cluster von Nervenzellen (13) (Abb. 4a und S11). Keiner der Zelltypen war einzigartig für hypoplastisches Myokard oder Kontrollmyokard (Tabelle S3). Innerhalb der Zelltypen gab es eine deutliche Heterogenität in der Genexpression. Im Vergleich zu den anderen Kardiomyozyten-Clustern war Cluster 0 mit Aktin-Bindungsstrukturen (Aktinin, Z-Discs, Zell-Zell-Adhärenz-Verbindungen) angereichert, was auf eine Rolle bei der mechanischen Stabilität hinweist, während die Kardiomyozyten-Cluster 3 und 10 mit Genen angereichert waren, die an der Proteinbiosynthese beteiligt waren. Diese Kardiomyozyten-Cluster können verschiedene Stadien der Kardiomyozyten-Reifung darstellen34. Innerhalb von Fibroblasten ist Cluster 1 mit Genen angereichert, die an der Proteinbiosynthese beteiligt sind, einschließlich traditioneller Fibroblastenmarker, wie z. B. Komponenten der extrazellulären Matrix. Cluster 2 ist mit Ionenkanälen angereichert und könnte einen Subtyp von Fibroblasten darstellen, der vorwiegend an der zellulären Kommunikation beteiligt ist35.

a UMAP-Diagramme von Kernen aus Kontroll- (links) oder gewundenen (hypoplastischen) linken Ventrikeln (rechts). Cluster wurden den wichtigsten Herzzelltypen zugeordnet: Adipozyten (8, 9), Kardiomyozyten (0, 3, 10), Endothelzellen (5, 15), Fibroblasten (1, 2), Leukozyten (4, 11), lymphatische Endothelzellen Zellen (12), Nervenzellen (13) und glatte Muskelzellen (6). b Cluster 7 exprimierte zellzyklusbezogene Gene (G2-Phase, Mitose). c Die Kerne von Cluster 7 wurden neu gruppiert und mit neuen Koordinaten angezeigt: Adipozyten (7.4), Kardiomyozyten (7.0, 7.3), Fibroblasten (7.1, 7.5), undefiniert (7.2). d Boxplots (Anteile der Kerne: mittlerer und interquartiler Bereich) in gewundenen (hypoplastischen) und linken Kontrollventrikeln, die einen signifikanten Anstieg des Anteils an Fibroblasten (*) und einen nicht signifikanten Rückgang der Kardiomyozytenkerne zeigen. Numerische Daten in Tabelle S5. Probengröße: n = 3 biologisch unabhängige Kontrollen, n = 3 biologisch unabhängige gewundene Lämmer.

Die Cluster 7 und 15 wurden mit G2-Phasen-/Mitose-bezogenen Genen angereichert (Abb. 4b), was auf eine hohe Zellzyklusaktivität hindeutet. Sie machten nur einen kleinen Prozentsatz der Gesamtzahl der Kerne aus, ohne dass es einen offensichtlichen Unterschied zwischen den Versuchsbedingungen gab (Cluster 7: Kontrolle 2,8 %, gewunden 2,3 %; Cluster 15: Kontrolle 0,3 %, gewunden 0,3 %. Wilcoxon-Test zwischen dem Zellverhältnis (Typen konnten keine signifikanten Unterschiede feststellen). Marker-Genexpressionsanalysen identifizierten Cluster 15 als Endothelzellen. Da wir nicht den gesamten Cluster 7 einem der wichtigsten Herzzelltypen zuordnen konnten, führten wir ein Sub-Clustering durch (Abb. 4c) und identifizierten zyklische Kardiomyozyten (Cluster 7.0, 7.3), zyklische Fibroblasten (Cluster 7.1, 7.5) und zyklische Adipozyten (Cluster 7.4; Abb. S12 und Tabelle S4). Bemerkenswerterweise stimmte die Anzahl der zyklischen Kardiomyozyten mit der Ki67-Färbung in der Literatur überein16.

Als nächstes beurteilten wir, ob sich das Myokard aus hypoplastischen LVs nur in der Menge unterschied oder ob sich die Zusammensetzung geändert hatte. Große Säugetiere verfügen über prominente fokale Ansammlungen epikardialer Adipozyten, die dazu führen können, dass Myokardproben nicht mehr repräsentativ sind. Eine gewickelte LV-Probe wurde von der Zusammensetzungsanalyse ausgeschlossen, da sie einen hohen Anteil an Adipozyten aufwies (Tabelle S5 und Abb. S13). Wir analysierten die Zellzusammensetzung anhand des Anteils jedes Zelltyps in Kontroll- und hypoplastischen LV-Proben mit zwei Methoden: einem exakten Fisher-Test (Abb. S14 und Tabelle S6) und einer multinomialen logistischen Dirichlet-Regression (Bayesian scCODA36 und frequentistisches Dirichlet Reg37,38 ( Tabelle S7. Alle Analysen ergaben einen signifikanten Anstieg der Fibroblasten. Sowohl scCODA als auch DirichletReg fanden einen etwa 1,4-fachen Anstieg der Fibroblasten, was 20,1 % der Kerne bei den Kontrollen gegenüber 28,7 % bei hypoplastischen Myokardien entspricht (Abb. 4d und Tabelle S7). Im Gegensatz dazu war der Anteil der Kardiomyozytenkerne in der hypoplastischen Myokardie verringert (59,1 % vs. 52,7 %; Abb. 4d). Dieser Rückgang war beim FET signifikant, nicht jedoch bei scCODA oder DirichletReg, wahrscheinlich aufgrund der größeren Probenvariabilität in der Kardiomyozytenzahl (Tabelle S3).

Obwohl wir einen einzigen Zeitpunkt in der Entwicklung untersucht haben (0,84 Schwangerschaftswochen), besteht jeder „Zelltyp“ aus einem Spektrum zellulärer Zustände, von denen einige vorübergehend sind. Wir untersuchten die Dynamik der Genexpression durch Abstammungsinferenz für die am häufigsten vorkommenden Zelltypen: Fibroblasten, Kardiomyozyten und Endothelzellen (Abb. 5, 6, S15, S16 und S17). Zellzyklusaktive Fibroblasten- und Kardiomyozyten-Subcluster wurden von unserer Pseudozeitanalyse ausgeschlossen, da die Zellzyklus-Regressionsanalyse darauf hinwies, dass es sich hierbei um zyklische reife Zellen handelte und nicht um eine Mannigfaltigkeit, die sich in reife Zelltypen differenzierte. Pseudozeitpunkte entlang des Fibroblastenverteilers waren mit der Reaktion auf TGF-beta-Signale, externe Reize und Chemikalien verbunden (Ergänzungsdaten 2 und Abb. S15). Beim Vergleich von Fibroblasten aus hypoplastischem und Kontrollmyokard haben wir unterschiedlich exprimierte Gene entlang der Pseudozeitachse identifiziert. In hypoplastischen linken Herzen hochregulierte Gene waren an der Organisation und Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ELN, COL12A1, FMOD, MATN4, ITGA7, BGN, AEBP1, KERA, GPC5) und an der Herzklappenmorphogenese (ELN, HEY2, CYR61) beteiligt. Herunterregulierte Gene wurden mit der Zelloberfläche assoziiert (IQGAP2, ABCA1; Abb. 5 und ergänzende Daten 2). Ähnliche Wege wurden identifiziert, als die unterschiedliche Genexpression nach Clustern analysiert wurde (Supplementary Data 3). Der Kardiomyozyten-Verteiler war mit Zellproliferation und Wachstumsregulation, elektrischer Kopplung und Aktin-vermittelter Zellkontraktion verbunden (Ergänzende Daten 2 und Abb. S16). Kardiomyozyten aus hypoplastischen linken Herzen exprimierten höhere Mengen an extrazellulären Matrixkomponenten (ELN, COL1A1, COL1A2, COL3A1, COL5A2, ITGB6, MFGE8) und an der Morphogenese beteiligten Genen (MYOM2, ELN, COL1A1, EYA4, HEY2, MFGE8, CYR61, CNTN4, ASTN2). , ANGPT1, COL1A2, COL3A1, ADIPOQ, FLNA). Hochregulierte Gene waren auch an der Signalübertragung des transformierenden Wachstumsfaktors (TGF)-Beta (COL1A1, COL1A2, COL3A1, SOX5) und der Integrinsignalisierung (ITGB6, MFGE8, CYR61, COL3A1; Abb. 6 und ergänzende Daten 2) beteiligt. Wir fanden auch eine Fehlregulation von Genen im Zusammenhang mit der Herzkontraktion, wie z. B. die Herunterregulierung von TPM2 und die Hochregulierung von MYL4. Die Expression von MYL4 (kodiert für eine leichte fetale Myosinkette) kann die Kontraktilität des Myokards verbessern und wurde bei einer Vielzahl angeborener Herzerkrankungen und Kardiomyopathien gefunden39,40. Die Ableitung der Endothellinie ergab eine Assoziation von Genen im Zusammenhang mit Signaltransduktion, Zellmigration, Wachstum und Bindung an die extrazelluläre Matrix. Die unterschiedliche Genexpression deutete auf eine Hochregulierung extrazellulärer Matrixbestandteile (VCAN, ELN, FN1, TNXB) und Gene hin, die mit der Glykosaminoglykanbindung assoziiert sind (VCAN, FN1, SLIT2, TNXB; Ergänzende Daten 2 und Abb. S17). Daher waren die Komponenten der extrazellulären Matrix in allen drei Zelltypen hochreguliert, was auf eine Induktion mesenchymaler Programme schließen lässt (Abb. S18).

ein Fibroblast-Verteiler (Kontrollen und gewickelte Proben gepoolt). b Heatmap, die unterschiedlich exprimierte Gene über Pseudozeit, Kontrollen (links) und gewundene (hypoplastische) linke Ventrikel (rechts) darstellt. c Genontologie (GO)-Anreicherungsanalyse unterschiedlich exprimierter Gene. Probengröße: n = 3 biologisch unabhängige Kontrollen, n = 4 biologisch unabhängige gewundene Lämmer.

a Kardiomyozyten-Verteiler (Kontrollen und gebündelte Proben gepoolt). b Heatmap, die unterschiedlich exprimierte Gene über Pseudozeit, Kontrollen (links) und gewundene (hypoplastische) linke Ventrikel (rechts) darstellt. c Genontologie (GO)-Anreicherungsanalyse unterschiedlich exprimierter Gene. Grün: biologischer Prozess; Orange: zellulärer Bestandteil; Blau: molekulare Funktion. Probengröße: n = 3 biologisch unabhängige Kontrollen, n = 4 biologisch unabhängige gewundene Lämmer.

CellChat ist eine explorative Analyse, die unterschiedlich regulierte Ligand-Rezeptor-Paare nach Zelltyp identifiziert. Mithilfe von CellChat haben wir Unterschiede in der zellulären Kommunikation zwischen Kontrolle und Spirale vorhergesagt. Wir haben 32 angereicherte Signalwege in den 8 Zellgruppen entdeckt, darunter Kollagen-, IGF-, FGF-, NOTCH- und VEGF-Signale (Abb. 7a, b). Während die Kommunikationsnetzwerkmuster in Kontrollproben und hypoplastischen Proben ähnlich waren, waren die Ausgangssignale bei Kontrollfibroblasten insgesamt stärker (Abb. 7a). Die unterschiedliche Kommunikation der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen deutete auf Veränderungen in der Signalübertragung des Fibroblasten-Wachstumsfaktors (FGF) und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) hin. Der FGF-Rezeptor FGFR1 wies eine höhere Expression in Endothelzellen aus hypoplastischem LV auf, während FGF2 in Adipozyten und Endothelzellen hochreguliert war (Abb. 7c, d). Die Expression des VEGF-Rezeptors war in Lymphzellen (FLT4; VEGFR3) und Endothelzellen (KDR; VEGFR2) fehlreguliert, während sein Ligand VEGFA in Kardiomyozyten aus hypoplastischem Myokard hochreguliert war (Abb. 7e, f). Weitere Belege wurden durch Differenzialanalyse mittels MAST (Supplementary Data 3) geliefert.

Die Mobilfunkkommunikation wurde zwischen „Kontroll“- und „gewickelten“ LV-Proben unter Verwendung der vier Netzwerkzentralitätsmaße von CellChat verglichen. Heatmaps der Kommunikationsintensität nach Signalmolekül (Zeilen) und Zelltyp (Spalten) mit ausgehenden (a) und eingehenden (b) Mustern. Randbalkendiagramme stellen die Gesamtsignalstärke für jeden Zelltyp (spaltenassoziiert) oder Signalweg (zeilenassoziiert) dar. Violindiagramme der normalisierten Genexpression innerhalb des Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF)-Signalwegs (c) und des VEGF-Signalwegs (e), biologisch relevante, hochregulierte Signalwege, die auch spiralspezifische, differenziell regulierte Ligand-Rezeptor-Paare enthalten. Kreisdiagramme modellieren die Kommunikation innerhalb des FGF-Signalwegs (d) und des VEGF-Signalwegs (f) über verschiedene Zelltypen hinweg. Probengröße: n = 3 biologisch unabhängige Kontrollen, n = 4 biologisch unabhängige gewundene Lämmer.

Insgesamt legt unser LVIO-Lammmodell nahe, dass das Wachstum der linken Herzstrukturen in der Schwangerschaftsmitte flussabhängig ist. Die snRNA-seq-Daten deuten auf einen erhöhten Anteil an Fibroblasten und eine Hochregulierung von Genen im Zusammenhang mit der extrazellulären Matrix und dem Gewebeumbau in verschiedenen Zelltypen hin. Die Modellierung der Zellkommunikation deutete auf Veränderungen in der FGF- und VEGF-Signalübertragung hin. Diese Befunde waren mit einer dickeren subendokardialen Bindegewebsschicht, aber keiner globalen Fibrose verbunden, was für dieses Stadium der pränatalen Entwicklung angemessen war.

Wir haben ein experimentelles HLHS-Modell erstellt, indem wir Spulen in den linken Vorhof fötaler Lämmer implantiert haben, um den Blutfluss in den LV in der Mitte der Schwangerschaft, lange nachdem die Kardiogenese abgeschlossen war, allmählich zu reduzieren. Das Modell rekapitulierte wichtige klinische Merkmale des fetalen HLHS, darunter einen verminderten antegraden Aortenklappenfluss, eine retrograde Perfusion des Gehirns, eine schwere Hypoplasie des linken Herzens und einen nicht spitzenbildenden linken Herzklappenverschluss. Das Myokard hypoplastischer LVs wies keine offensichtliche Fibrose, sondern eine verdickte subendokardiale Bindegewebsschicht auf, und transkriptomische Analysen zeigten quantitative und qualitative Veränderungen in der Zellzusammensetzung, der Genexpression und den interzellulären Signalnetzwerken.

Das von unseren Experimenten mit fötalen Lämmern erfasste Intervall (0,52–0,84 Schwangerschaftswochen) entspricht 20–34 Schwangerschaftswochen beim Menschen. Es wurde beobachtet, dass sich die fetale Aortenstenose beim Menschen in diesem Zeitraum zu einem HLHS entwickelt7, was durch das Vorhandensein eines retrograden Flusses im transversalen Aortenbogen32 vorhergesagt wird. Der Schweregrad der Flussstörung in unserem Modell kann für den AAo geschätzt werden: Der normale antegrade Fluss durch den AAo und die Koronararterien beträgt 35–40 % bzw. ~4 % des kombinierten ventrikulären Outputs. Bei Feten ohne antegraden AAo-Fluss ist der AAo nur ein Kanal für die Koronararterien und hat daher nur ein Zehntel des normalen Flussvolumens in die entgegengesetzte Richtung41. Eine so starke und anhaltende Abnahme des LV-Zuflusses reichte aus, um ein verringertes Wachstum der stromabwärts gelegenen Strukturen zu verursachen, was zu LVs ohne Apexbildung mit kleinen Aortenklappen und AAo führte (Abb. 2 und Tabelle 1).

Die zellulären und molekularen Grundlagen des kardiovaskulären Wachstums sind ein aktives Forschungsgebiet. Aus der Massen-RNA-Sequenzierung geht hervor, dass einige der unterschiedlich exprimierten miRNAs mit der Zellproliferation und dem Entzug des Zellzyklus in Zusammenhang stehen, z. B. miR-15a-5p33. Aus der gepoolten Genexpression von Tausenden von Zellen unterschiedlicher Art und unterschiedlichen Zustands konnten wir jedoch keine eindeutige globale Reaktion des Myokardgewebes auf einen niedrigen linken Herzfluss ableiten. Wir verwendeten daher snRNA-seq, um die Reaktion verschiedener Myokardzelltypen im Hinblick auf Veränderungen in ihrer Population und ihren Transkriptomen zu untersuchen36. Die größte Veränderung in der Zellzusammensetzung war ein ca. 1,4-facher Anstieg des Anteils der Fibroblasten von 20,1 % (Kontrollen) auf 28,7 % (gewunden) der Zellkerne, was bei allen Proben konsistent war. Da sich die Proportionen zu Eins summieren, führt die proportionale Zunahme eines Zelltyps zwangsläufig zu einer Abnahme bei anderen. In unserem hypoplastischen LV-Myokard beschränkte sich dies auf eine Abnahme der Kardiomyozytenkerne (Abb. 4d) von 59,1 % (Kontrollen) auf 52,7 % (gewunden). Somit war ein Versagen des LV-Wachstums in unserem LVIO-Modell mit einer Veränderung der Zelltypfraktionen verbunden, was darauf hindeutet, dass die mechanischen Signale des Blutflusses und der diastolischen Vorlast einen unterschiedlichen Einfluss auf die Proliferation und/oder Differenzierung von Fibroblasten und Kardiomyozyten hatten. Die Transkriptome hypoplastischer Ventrikel bei der Schwangerschaft 0,84 (75 Tage nach Beginn der LVIO) spiegeln Prozesse der Gewebeumgestaltung wider und nicht frühe Signalwege. Es wurde festgestellt, dass mehrere Zelltypen, darunter Fibroblasten, Kardiomyozyten und Endothelzellen, eine erhöhte Expression extrazellulärer Matrixkomponenten aufweisen (Abb. S18). Die Schlussfolgerung bekannter Ligand-Rezeptor-Gruppen und die Modellierung zellulärer Kommunikationsnetzwerke ließen eine veränderte Signalübertragung innerhalb der FGF- und VEGF-Signalwege vorhersehen (Abb. 7)42,43,44,45. Eine Hochregulierung von Kollagenen oder anderen extrazellulären Matrixproteinen in Endothelzellen ist eines der Kennzeichen des Übergangs von Endothel zu Mesenchym (EndMT), und sowohl die FGF2-Signalisierung durch FGFR1 als auch die VEGF-A-Signalisierung durch VEGFR2 haben sich als schützend oder hemmend gegen EndMT erwiesen46,47 ,48,49. Daher wiesen hypoplastische LVs Merkmale auf, die auf eine aberrante und ektopische Induktion der mesenchymalen und profibrotischen Signalübertragung hindeuteten, einschließlich einer hochregulierten Expression extrazellulärer Matrixkomponenten, einer erhöhten Häufigkeit von Fibroblasten und Fehlregulationen der FGF- und VEGF-Signalisierung als potenzielle Anti-EndMT Antworten (Ergänzende Diskussion).

In Übereinstimmung mit diesen zellulären und molekularen Veränderungen wies das hypoplastische Myokard eine deutlich dickere Schicht subendokardialen Bindegewebes auf. Bei Kindern mit HLHS war eine dicke endokardiale Schicht aus zellulärem fibroelastischem Gewebe, die als endokardiale Fibroelastose (EFE) bezeichnet wird, mit einer pathologischen EndMT verbunden und galt als prädiktiv für klinische Ergebnisse, beispielsweise nach fetalen Eingriffen50,51. Während in diesem fötalen Lammmodell von HLHS keine schwere Fibrose in der Histologie auftrat, entwickelt sich der größte Teil der kardialen Kollagenmatrix postnatal52,53. Eine fibrotische Reaktion kann daher nach der Geburt deutlicher auftreten oder wenn im fetalen Leben eine Drucküberlastung auftritt, z. B. durch eine Aortenstenose. Bemerkenswerterweise wurde eine subendokardiale Verdickung und Fibrose mit Kollagenablagerung im Modell der linken Vorhofligatur von Hühnerembryonen von HLHS54 beobachtet, und intrinsische endokardiale Defekte und abnormale EndMT wurden im menschlichen HLHS iPSC26 gefunden. Sogar subtile Verbesserungen des Kollagennetzes zwischen und parallel zu Myozyten52,53 könnten die Steifheit des Myokards erhöhen und das Wachstum begrenzen, indem sie die Übertragung mechanischer Signale dämpfen und als physikalische Einschränkung für die Verlängerung und das Wachstum der Kardiomyozyten wirken.

Der Nachweis einer Linksherzhypoplasie als Folge eines niedrigen linken Herzflusses untergräbt nicht die Bedeutung einer genetischen Veranlagung für HLHS und strukturelle Linksherzerkrankungen55. Es zeigt vielmehr den Einfluss hämodynamischer Kräfte auf die Übersetzung von Genotypen in Phänotypen, was zu einigen der klinisch verheerendsten morphologischen Merkmale von HLHS führt. Die Komplexität der Kaskaden, die genetische Variation in eine klinische Erkrankung umsetzen, spiegelt sich in der heterogenen genetischen Architektur von Linksherzfehlbildungen wider. Zum klinischen Spektrum tragen zahlreiche De-novo- und seltene vererbte Varianten bei, darunter verschiedene mit EndMT assoziierte Gene (FGFR2, FOXP1, GATA4, GJA1, NKX2-5, NOTCH1, NR2F2, SMAD3)27,56. Andere genetische Veranlagungen können zu strukturellen oder funktionellen Herzanomalien führen, die unweigerlich den Fluss des linken Herzens verändern, was wiederum zu morphologischen Veränderungen des wachsenden Herzens führt, was eine Form der Interaktion zwischen Genen und der inneren Umgebung darstellt. Die Übertragung mechanischer Signale, des Flusses und der diastolischen Vorlast kann ebenfalls anfällig für Allelvariationen sein. Eine komplexe Ätiologie wird durch die digenische Vererbung (SAP130, PCDHA9) einer Linksherzhypoplasie mit einem ventrikulären Septumdefekt bei der Ohia-Maus57 veranschaulicht und durch das Auftreten einer Erkrankung des rechten Herzens statt einer Erkrankung des linken Herzens (Trikuspidalklappendysplasie/-atresie) und zusätzlicher Herzerkrankungen verstärkt. Herzanomalien bei Schweinen wurden als SAP130-Mangel eingestuft58.

Schafe sind die bevorzugte Tierart für Studien zur fetalen Säugetierphysiologie, insbesondere wenn eine Instrumentierung erforderlich ist. Allerdings stellen sie aufgrund ihrer reproduktiven Saisonalität, ihrer Kosten, ihres begrenzten molekularen Werkzeugkastens und ihrer Auswahl an Reagenzien, z. B. Antikörpern oder annotierten genomischen Assemblies, erhebliche Einschränkungen dar16,30. Die ersten Erkenntnisse aus diesem Modell werfen sofort Fragen auf, die wir in zukünftigen Studien untersuchen werden. Gibt es beispielsweise ein Entwicklungsfenster, in dem sich Flussstörungen auswirken, und variiert dieses zwischen den Strukturen des linken Herzens? Wir gehen davon aus, dass Strömungseffekte ihre größte Auswirkung haben werden, solange die Kardiomyozyten bis zur Schwangerschaftsdauer von etwa 0,75–0,9 Jahren noch schnell vermehren16,30. Sobald die perinatale Verlangsamung der Kardiomyozyten-Proliferation eintritt, besteht nur noch wenig Potenzial für ein aufholendes Wachstum durch Kardiomyozyten-Hyperplasie, und das Wachstum durch Hypertrophie kann durch Fibrose eingeschränkt werden. Die Entwicklung neuer Wirkstoffe und Interventionen für HLHS erfordert ein mechanistisches und molekulares Verständnis der Linksherzhypoplasie. Große Säugetiermodelle der Linksherzhypoplasie werden für die präklinische Bewertung von Behandlungen, sei es chirurgische, interventionelle Katheterisierung oder medikamentöse Therapien, von entscheidender Bedeutung sein. Dazu gehört die Erforschung von Wirkstoffen zur Förderung der Kardiomyozytenproliferation und zur Überwindung des verringerten physiologischen Flussstimulus und der fibrotischen Einschränkungen. Unser Modell rekapituliert die Strömungsmuster des menschlichen fötalen HLHS mit retrograder Perfusion des Gehirns und der Koronararterien aus dem Arteriengang und ermöglicht außerdem eine Bewertung der Auswirkungen dieser Physiologie auf die Entwicklung anderer Organe, einschließlich des Gehirns.

Der allmähliche Beginn einer schweren Obstruktion des linksventrikulären Zuflusses in der Mitte der Schwangerschaft führte zu einer starken, anhaltenden Abnahme des Flusses im linken Herzen, die ausreichte, um zu einer eindeutigen Hypoplasie des linken Herzens zu führen. Dies impliziert, dass das physiologische Wachstum des linken Herzens fetaler Säugetiere nach der Kardiogenese flussabhängig ist. Myokard, das einer geringen Durchblutung ausgesetzt war, wies einen erhöhten Anteil an Fibroblasten und eine Hochregulierung der Gene für die extrazelluläre Matrix und den Gewebeumbau in mehreren Zelltypen auf, was auf eine ektope mesenchymähnliche Signalübertragung hindeutet. Eine Anfälligkeit für profibrotische pränatale Gewebeumgestaltung könnte das Herzwachstum und die Herzfunktion weiter beeinträchtigen, einschließlich des Ergebnisses fetaler und früher postnataler Eingriffe.

Wir haben alle relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche eingehalten. Alle Verfahren folgten den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und wurden vom Council on Animal Care der University of Western Ontario genehmigt (Protokoll 2010-257). Trächtige Dorset × Rideau Arcott-Mutterschafe (Gestationsalter 76 Tage, Laufzeit 147 Tage) wurden nüchtern (16 Stunden feste Nahrung, 6 Stunden Wasser) und mit Ketoprofen (3 mg/kg; Anafen, Boehringer Ingelheim) vorbehandelt. Die Anästhesie wurde mit 7–20 mg/kg intravenösem (IV) Natriumpentothal eingeleitet (typischerweise ~ 1 g in eine innere Halsvene; Abbott Laboratories Ltd, Montreal, Kanada) und mit 1–3 % Isofluran und 5–6 l/min aufrechterhalten O2. Die Mutterschafe wurden mittels Herzfrequenz, Blutdruck, Pulsoximetrie und endexspiratorischer Kapnographie überwacht. Anschließend wurde Ultraschall verwendet, um die Wurfgröße zu bestimmen und, falls mehrere Exemplare festgestellt wurden, zu entscheiden, welcher Fötus die beste Lage für die Spulenimplantation hatte.

Die Spulen wurden unter kontinuierlicher Ultraschallkontrolle (Philips HDI 5000) vollständig perkutan und unter streng aseptischen Bedingungen in das linke Herz implantiert. Diese Technik wurde von der Technik übernommen, die in unserer klinischen Praxis für fetale Herzinterventionen beim Menschen verwendet wird59. Eine 20-G-Nadel (6 Zoll Quincke; Beckton-Dickinson) wurde verwendet, um Platinspiralen (0,018 Zoll IDC, Boston Scientific) über der Mitralklappe einzuführen, bis der LV unterfüllt schien und der aufsteigende Aortenfluss abnahm oder retrograd wurde. Für 3 Tage nach dem Eingriff wurde eine Antibiotikaprophylaxe verabreicht (Trimethoprim-Sulfadoxin; 16 mg/kg im Trivetrin, Schering-Plough). Weitere Informationen zu Geschlecht und Alter der Feten in Tabelle S2.

Fünfundvierzig bis fünfzig Tage nach der Spulenimplantation (0,84 Trächtigkeit) wurden Mutterschafe anästhesiert und es wurden fetale Echokardiogramme durchgeführt, um die enddiastolischen und postsystolischen Abmessungen von LV und RV, die Durchmesser der Aortenklappe, der Pulmonalklappe und der aufsteigenden Aorta (AAo) zu messen Hauptpulmonalarterie (PA; Tabelle S2). Die Farbflusskartierung wurde verwendet, um die Flusseigenschaften der Mitralklappe, der Aorta, des Duktus und des Vorhofseptums zu bewerten.

Unter mütterlicher Vollnarkose und nach fetaler Echokardiographie wurden fetale Lämmer durch Hysterotomie entbunden. Die Nabelschnur wurde abgeklemmt und das Lamm mit intravenös verabreichtem Natriumpentobarbital (BimedaMTC, Cambridge, Kanada) eingeschläfert. Zur Entnahme des Herzens wurde eine mittlere Sternotomie durchgeführt, anschließend wurden Proben aus dem linken Ventrikel (LV), dem rechten Ventrikel (RV), dem AAo und dem Haupt-PA des Fötus entnommen. Das Gewebe wurde entweder mit flüssigem N2 schockgefroren und bei –80 °C gelagert (Transkriptomanalysen) oder in 4 % Formalin fixiert (Histologie). Das Mutterschaf wurde mit Pentobarbital eingeschläfert, nachdem alle Föten entfernt worden waren.

Linksventrikuläre Myokardproben wurden von fötalen Lämmern entnommen (n = 4 stark hypoplastische linke Herzen, n = 7 Kontrollen). Nach 24-stündiger Fixierung in 4 % Formalin wurde das Gewebe 3 Tage lang in frische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 7 Tage lang in 70 % Ethanol überführt, dann blockiert und in Paraffin eingebettet. Die Färbungen wurden in der STTARR-Einrichtung (Innovation Centre for Advanced Preclinical Imaging and Radiation Research), Toronto, Kanada (Elastic Trichrome und TUNEL) oder im Centre for Phenogenomics, Toronto, Kanada (Picro-Sirius Red) durchgeführt. Zur Beurteilung der Histologie und der endo-/subendokardialen Dicke wurde eine elastische Trichromfärbung verwendet. Die Apoptose wurde mit dem TUNEL-Assay bewertet. Die Ablagerung von Bindegewebe und Kollagen wurde durch Picro-Sirius-Rot-Färbung beurteilt.

Die elastische Trichrom-Färbung ist eine Kombination aus der elastischen Verhoeff-Färbung und dem Masson-Trichrom, die zur Unterscheidung von Kollagen von glatter Muskulatur und zum Nachweis elastischer Fasern verwendet wird. Serienschnitte mit einer Dicke von 4–5 μm wurden in der Querebene geschnitten, entparaffiniert und in Xylol (3 × 2 Minuten), 100 % und 95 % Ethanol und Wasser rehydratisiert. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei 56° Celsius in Beizmittel-Bouin-Lösung (Polysciences Inc.) inkubiert, 10 Minuten lang in Wasser gewaschen, dann 1 Stunde lang mit elastischem Verhoeff-Färbemittel (siehe unten) gefärbt und in destilliertem Wasser gewaschen. Die Schnitte wurden mikroskopisch in 2 % Eisenchlorid differenziert, bis elastische Fasern deutlich erkennbar und der Hintergrund farblos bis hellgrau war. Die Schnitte wurden 2 Minuten lang in Biebrich-Scharlachrot und saurer Fuchsinlösung gefärbt, in destilliertem Wasser gespült, 15 Minuten lang in 5 %ige Phosphorwolframsäurelösung gelegt, 10 Minuten lang mit 2 %iger hellgrüner Lösung gefärbt und 30 Minuten lang in 1 %ige Essigsäurelösung gelegt s, dehydriert mit 95 % und 100 % Ethanol + Xylol und dann mit synthetischen Eindeckmedien montiert. Elastische Verhoeff-Färbung: Alkoholisches Hämatoxylin, 5 % (30 ml), Eisenchlorid, 10 % Lösung (12 ml), Lugol-Jod (12 ml; 100 mg/ml Kaliumjodid und 50 mg/ml Jod).

Serienschnitte mit einer Dicke von 4–5 μm wurden in Querebene geschnitten, entparaffiniert und in Xylol (2 × 5 Minuten), 100 %, 95 %, 70 % Ethanol (5 Minuten) und Wasser rehydratisiert. Die endogene Peroxidaseaktivität wurde in 3 % H2O2 in 1x PBS für 15 Minuten blockiert. Die Schnitte wurden 5 Minuten lang in Wasser gewaschen. Der Enzymverdau wurde mit 10 μg/ml Proteinase K in 1x PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Gewebeschnitte wurden mit einem Pap-Pen umrandet und 2 × 3 Minuten in 1 x PBS-T gewaschen. Es wurde eine serumfreie Proteinblockierungslösung aufgetragen, 2–3 Tropfen pro Objektträger für 20 Minuten bei Raumtemperatur (Dako). Das TdT-Enzym wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers (Terminal Transferase, Biotin-16-dUTP; Roche) hergestellt und die Schnitte 1 Stunde lang bei 37 ° C inkubiert. Die Schnitte wurden 3 × 3 Minuten lang in 1 × PBS-T gewaschen, 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Vectastain ABC-Kit (Vector Laboratories) inkubiert, 3 × 3 Minuten lang in 1 × PBS-T gewaschen und 10 Minuten lang im DAB-Substrat-Kit inkubiert min (Abcam), 5 min in Wasser gewaschen, durch eine abgestufte Alkoholreihe dehydriert, in Xylol geklärt und auf Deckgläser montiert.

Celestine Blue (Celestine Blue 2,5 g, Eisenalaun (Eisen-Ammoniumsulfat) 25 g, destilliertes Wasser 500 ml). Picro-Sirius Red (0,1 % wässriges Sirius Red F3B (CI 35780) 5 ml, gesättigte wässrige Pikrinsäure 45 ml). Serienschnitte mit einer Dicke von 5 μm wurden in der Querebene geschnitten, in Xylol entparaffiniert (3 Wechsel, insgesamt 3 Minuten), in 100 % Ethanol getaucht (3 Wechsel, jeweils 10 Eintauchen), in Wasser überführt und 5 Minuten lang in Celestinblau gefärbt , in Wasser gewaschen, 5 Minuten lang in Harris-Hämatoxylin gefärbt, in Wasser gewaschen, in saurem Alkohol differenziert (5 Eintauchvorgänge), in Wasser gewaschen und 30 Minuten lang mit Pico-Sirius-Rot gefärbt. Nach dem Blot-Trocknen wurden die Schnitte in 100 % Ethanol (4x) und Xylol (3x, jeweils 10 Tauchgänge) dehydriert, mit einem Deckglas versehen und in Permount montiert. Ergebnisse: Kollagen, Retikulin, Basalmembran – rot. Mit Polarisationsmikroskopie: Große Fasern – gelbe oder orange Doppelbrechung; dünne Fasern – grüne Doppelbrechung; Kollagen Typ 4 – nicht doppelbrechend; Kerne – schwarz; Elastin, Muskel, Zytoplasma – gelb.

Das Scannen des Objektträgers wurde in der Bildgebungseinrichtung des Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada, durchgeführt (Zeiss-Epifluoreszenzmikroskop, 20x/0,75-Objektiv). Elastische Trichrom- und TUNEL-Färbungen: Die Bildvisualisierung und -analyse wurde mit der CaseViewer-Software (3DHISTECH Ltd.) durchgeführt. Die Dicke der endo-/subendokardialen Schicht (Abstand zwischen Endothel und Muskelschicht in µm) wurde in mit elastischem Trichrom gefärbten Schnitten der freien Wände des linken Herzens bestimmt. Diese Schicht enthielt Endothel, endokardiales Bindegewebe, Subendokard und Purkinje-Fasern. In jeder Probe wurden mehrere Dickenmessungen durchgeführt (ca. alle 50–100 µm) und eine Analyse mit wiederholten Messungen wurde als lineares Mischeffektmodell durchgeführt, wobei die Behandlung ein fester Effekt und die Probe ein zufälliger Effekt war. Picro-Sirius Red-Färbungen: Die Bildanalyse wurde mit der Halo-Software (v3.1.1076.301) durchgeführt. Die Bilder wurden mit einer angepassten Version des Halo-Quantifizierungsalgorithmus analysiert.

RNA aus den freien Wänden von LV und RV, AAo und PA wurde mit dem miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) extrahiert. Drei Proben stammten von stark hypoplastischen Herzen (die auch für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung verwendet wurden) und eine stammte von einem mäßig hypoplastischen Herzen. Als Kontrollen wurden vier Proben sequenziert. RNA-Proben hatten ein A260/A280-Verhältnis von 2,06–2,07 und wurden auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 RNA Nano-Chip auf Integrität überprüft. Die Konzentration wurde mittels Qubit RNA HS Assay auf einem Qubit-Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, USA) gemessen. Die Proben wurden zur Vorbereitung und Sequenzierung kleiner RNA- und rRNA-Depletion-Bibliotheken am Center for Applied Genomics (TCAG) des Hospital for Sick Children eingereicht.

Für die Sequenzierung von langer nichtkodierender RNA und Poly(A)-mRNA wurde die Vorbereitung der RNA-Seq-Bibliothek gemäß dem TruSeq Stranded Total RNA Library-Vorbereitungsprotokoll (Illumina, USA) mit dem Ribo-Zero Gold rRNA-Entfernungskit durchgeführt. Kurz gesagt wurden 600 ng Gesamt-RNA als Ausgangsmaterial verwendet und der rRNA-Abreicherung unter Verwendung biotinylierter Perlen unterzogen, die rRNA-Targeting-spezifische Oligos enthalten. rRNA-abgereicherte RNA-Proben wurden 4 Minuten lang bei 94 °C in Bereiche von 200–300 Basen fragmentiert und in doppelsträngige cDNA umgewandelt, am Ende repariert und am 3'-Ende adenyliert, um einen Überhang A zu erzeugen, der die Ligation von ermöglicht Illumina-Adapter mit einem Überhang T. Bibliotheksfragmente wurden unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 10 s, gefolgt von 12 Zyklen bei 98 °C für 10 s, 60 °C für 30 s und 72 °C für 30 s und abschließend ein Verlängerungsschritt für 5 min bei 72 °C. Im Amplifikationsschritt wurde jede Probe mit einem anderen Barcode-Adapter amplifiziert, um eine Multiplex-Sequenzierung zu ermöglichen. Ein µl jeder RNA-seq-Bibliothek wurde auf einen Bioanalyzer 2100 DNA High Sensitivity Chip (Agilent Technologies, USA) geladen, um die Größe und Abwesenheit von Primerdimeren zu überprüfen; RNA-Bibliotheken wurden durch qPCR unter Verwendung des Kapa Library Quantification Illumina/ABI Prism Kit-Protokolls (Sigma Aldrich, USA) quantifiziert. Bibliotheken wurden in äquimolaren Mengen gepoolt und auf einer NovaSeq 6000-Plattform (Illumina) am gepaarten Ende sequenziert. Dabei wurden zwei Spuren einer S2-Durchflusszelle gemäß dem von Illumina empfohlenen Protokoll verwendet, um gepaarte Lesevorgänge mit einer Länge von 150 Basen zu generieren, was zu ~90 M gepaart führte -end liest pro Probe.

Die Vorbereitung einer kleinen RNA-Bibliothek wurde gemäß dem NEBNext Small RNA Library Prep Set for Illumina-Protokoll durchgeführt (bei einer Aortenprobe schlug die Bibliotheksvorbereitung fehl). Kurz gesagt, 600 ng Gesamt-RNA wurden verwendet, um Illumina-kompatible Adapter am 3'-Ende zu ligieren, gefolgt von der Hybridisierung mit dem Reverse-Transkriptions-Primer, der die Bildung von Adapterdimeren verhindert; Anschließend wurden 5'-Endadapter an die kleine RNA ligiert, und mit dem Adapter ligierte kleine RNA-Moleküle wurden revers transkribiert und durch PCR mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 °C für 30 s, gefolgt von 15 Zyklen bei 94 °C für 15 s, amplifiziert. 62 °C für 30 s und 70 °C für 15 s und ein letzter Verlängerungsschritt für 5 min bei 70 °C. Im Amplifikationsschritt wurde jede Probe mit einem anderen Barcode-Adapter amplifiziert, um eine Multiplex-Sequenzierung zu ermöglichen. Ein µl jeder kleinen RNA-Bibliothek wurde auf einen Bioanalyzer 2100 DNA High Sensitivity Chip geladen, um die Größe und das Fehlen von Primerdimeren zu überprüfen. RNA-Bibliotheken wurden durch qPCR unter Verwendung des Kapa Library Quantification Illumina/ABI Prism Kit-Protokolls quantifiziert. Bei einer Aortenprobe schlug die Bibliotheksvorbereitung zweimal fehl. Die Bibliotheken wurden in äquimolaren Mengen gepoolt und auf 2 Spuren einer Rapid Run Mode-Durchflusszelle mit der V3-Sequenzierungschemie auf einer HiSeq 2500-Plattform (Illumina) für 50 Basen einzeln sequenziert, wobei dem von Illumina empfohlenen Protokoll gefolgt wurde, was zu fast 8 Millionen Lesevorgängen führte pro Probe.

Sequenzierung der Lesevorgänge: Wir haben STAR und das aktuellste Schafgenom „oviAri4“ verwendet, um die Lesevorgänge zu kartieren. Für alle Proben wurden die gewünschten Kartierungsraten (85–90 %) erreicht und etwa 80 % der kartierten Lesevorgänge wurden erfolgreich annotierten Genkörpern zugeordnet, was darauf hindeutet, dass die Datenqualität insgesamt hoch und zuverlässig ist. Zwei AAo-Kontrollproben wurden aus den Analysen entfernt (342284_2, 342287_1), da festgestellt wurde, dass sie ein hohes Maß an Myokardgenen exprimieren (wie NPPA, MYL4, ANKRD1, MYL7, MYPN und CSRP3), was auf eine mögliche Kontamination mit hinweist Herzgewebe. Exons wurden mithilfe von featureCounts zur Oar_V4.0-Genomannotation gezählt. Zur Beurteilung der Qualität des Datensatzes wurde die Korrelation der Genexpressionswerte zwischen allen Proben herangezogen.

Differentialexpressionsanalyse: Die Zählungen wurden mit RUV-seq60 normalisiert und differentiell exprimierte Gene wurden mit EdgeR berechnet (log2-fache Änderung > 1 und an die Falscherkennungsrate (FDR) angepasster p-Wert < 0,05). Kurz gesagt, bei kleinen RNA-seq-Reads wurden Adaptersequenzen mit der BBMap-Suite getrimmt, um Reads mit weniger als 23 Nukleotiden nach dem Trimmen beizubehalten. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von miRDeep2 an das OviAri4-Genom und die Oar_v4.0-Annotation angepasst.

Verarbeitung sequenzierter Lesevorgänge: FastQC (v0.11.7) wurde verwendet, um die Qualität sequenzierter Lesevorgänge zu untersuchen (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). BBDuk (BBMap Suite v37.90) (https://sourceforge.net/projects/bbmap/) wurde verwendet, um Adaptersequenzen aus Lesevorgängen mit von der BBMap Suite bereitgestellten Referenzadaptersequenzen und den Einstellungen „hdist=1 mink=11“ für klein zu kürzen RNA-seq liest. Für die miRNA-Größenspezifität wurden nur Lesevorgänge mit einer Länge von <23 Nukleotiden beibehalten. Nach dem Trimmen wurde FastQC verwendet, um die Qualität der getrimmten sequenzierten Lesevorgänge zu untersuchen. miRDeep2 mapper.pl61 wurde mit Standardparametern verwendet, um Reads mit einer Länge von mindestens 18 Nukleotiden auf das Schafgenom (Ovis aries) (Oar_v4.0) abzubilden. Bekannte und neue miRNAs wurden mithilfe des miRDeep2-Hauptalgorithmus (miRDeep2.pl) mit Standardparametern identifiziert. Für bekannte miRNAs wurden die reifen miRNA-Sequenzen in Schafen von miRBase (v22.1)62 erhalten. Für neuartige miRNAs wurden nur diejenigen mit einem miRDeep-Score ≥2 für die nachgelagerte Analyse zurückbehalten.

Differenzielle miRNA-Expressionsanalyse: Die differenzielle miRNA-Expressionsanalyse wurde in R (v4.0.3) durchgeführt. Erstens wurden neuartige miRNAs ausgeschlossen, die in <75 % der Replikate innerhalb einer bestimmten Gewebebehandlungsgruppe vorkommen. Zweitens wurden neue und reife miRNAs mit einer logarithmisch transformierten Anzahl von ≥ 1 in 75 % der Replikate für eine bestimmte Gewebebehandlungsprobe für die nachgelagerte Analyse aufbewahrt. RUV-seq (v1.24.0)60 wurde angewendet, um unerwünschte Variationen mithilfe von Replikatproben (RUVs mit k = 2) zu entfernen. Differenziell exprimierte (DE) miRNAs wurden für die Behandlung identifiziert (absoluter log2FC > 1, FDR-bereinigter p-Wert < 0,05; ergänzende Daten 1) – Kontrolle in jedem Gewebe unter Verwendung von DESeq2 (v 1.30.1)63. Geschrumpfte log2FCs wurden mit dem „normalen“ Schrumpfungsschätzer berechnet. Reife Sequenzen von DE-neuen miRNAs wurden verwendet, um bekannte miRNA-Homologe basierend auf Sequenzähnlichkeit in anderen Arten mit der Funktion „Einzelsequenzsuche“ auf miRBase (v22.1) mit der SSEARCH-Suchmethode zu identifizieren.

Identifizierung von miRNA-Zielgenen: Rechnerisch vorhergesagte und experimentell validierte Zielgene unterschiedlich exprimierter miRNAs in AAo und LV wurden mit multiMiR (v1.12.0)64 identifiziert. Für experimentell validierte Zielgene wurden die Quellen auf „miRTarBase“, „TarBase“ und „miRecords“ beschränkt, wobei der Parameter „validated“ in multiMiR verwendet wurde. Humane Homologe von DE-miRNAs wurden aus der reifen miRNA-Sequenz mit der SSEARCH-Suchmethode auf miRBase (v22.1) identifiziert und als Eingabe verwendet. Wenn keine menschlichen Homologen identifiziert werden konnten, wurde die DE-miRNA von der Gen-Ziel-Identifizierung ausgeschlossen. Potenzielle Zielgene wurden nach differentiell exprimierten Genen in AAo oder LV vorgefiltert, mit gegensätzlichen Expressionsunterschieden zwischen Coil-behandelter und Kontrollgruppe im Vergleich zur differentiell exprimierten miRNA im gleichen jeweiligen Gewebe. Beispielsweise würden Zielgene einer miRNA, die in spulenbehandelten AAo-Proben stärker exprimiert wird, anhand von Genen identifiziert, die in Kontroll-AAo-Proben stärker exprimiert werden. Identifizierte Zielgene wurden dann mithilfe von biomaRt (v2.46.3) von menschlichen in Schaf-Orthologe umgewandelt. Fehlende Orthologe wurden manuell mithilfe der Gene-Ressource von NCBI abgerufen.

Die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq) wurde am Princess Margaret Genomics Centre, Toronto, Kanada, durchgeführt. Der Versuchsaufbau bestand aus vier hypoplastischen Linksherzproben von Lämmern und drei Kontrollen. Gewebe der freien Wand des linken Ventrikels (30–50 mg pro Probe) wurde mit gekühlten Rasierklingen (Fisher Scientific) mechanisch in 1–2 mm3 dissoziiert. Um Kerne zu isolieren, wurde das Gewebe in Lysepuffer suspendiert (für 5 Minuten) und mit einem Dounce-Homogenisator (Sigma-Aldrich) homogenisiert. Intakte Kerne wurden durch SYBR Green II RNA Gel Stain (10.000-faches Konzentrat in DMSO; Thermo Fisher Scientific) verifiziert. Die resuspendierten Kerne wurden gezählt und die Pellets wurden zweimal in Resuspensionspuffer gewaschen. Die Resuspension wurde mit einem 40-µm-Flowmi-Zellsieb (Sigma-Aldrich) filtriert und in ein 1,5-ml-LoBind-Röhrchen (Sigma-Aldrich) überführt. Die Kerne wurden erneut gezählt und mit DAPI (Sigma-Aldrich) in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen inkubiert. Um Trümmer oder Kernaggregate auszuschließen, wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) mit einem BD Influx-Zellsortierer (BD Biosciences) durchgeführt, wobei die DAPI-Positivität überprüft wurde (für 1–1,5 Stunden). Die Kerne wurden gesammelt, mit Resuspensionspuffer gewaschen und anschließend gezählt. Die 10x Chromium-Einzell-Genexpressionstechnologie (3′ v2 10x Genomics) wurde verwendet, um einfach indizierte Bibliotheken gemäß den Protokollen des Herstellers zu generieren. Die RNA-Sequenzierung wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers auf einer HiSeq X- (LV 1 und 2) oder NovaSeq 6000-Plattform (LV 3 und 4) (Illumina) durchgeführt.

0,32 mM Saccharose (Sigma-Aldrich), 5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich), 3 mM Mg(Ac)2 (Sigma-Aldrich), 20 mM Tris-HCl 7,5 (Fisher Scientific), 0,1 % Triton X-100 (Sigma -Aldrich), 0,1 mM EDTA 8,0 (Sigma-Aldrich), 40 U/ml RNase-Inhibitor (Sigma-Aldrich), in UltraPure DNase/RNase-freiem destilliertem H2O (Fisher Scientific). Resuspensionspuffer: 1x PBS (pH 7,4; Thermo Fisher Scientific), 1 % BSA (MACS Miltenyi Biotec) und 0,2 U/µl RNase-Inhibitor (Sigma-Aldrich).

Eine erste Kartierung der snRNA-seq-Reads wurde mit Cell Ranger v3 (10x Genomics) und einem „Pre-Mrna“-Referenztranskriptom (d. h. vor dem Spleißen) durchgeführt, das aus der NCBI-Genomassemblierung 4.0 von O. aries abgeleitet wurde. Dieser Ansatz führte zu einer Zuordnung von Sequenzierungs-Reads zu etwa 25 % auf mutmaßliche intergenische Regionen. Zum Vergleich: Menschliche snRNA-seq-Proben produzieren typischerweise <3 % der Lesevorgänge, die auf intergene Regionen abgebildet werden. Wir stellten die Hypothese auf, dass einige der mutmaßlichen intergenen Regionen von O. aries tatsächlich nicht annotierte offene Leserahmen waren. Um dies zu testen, haben wir Massen-RNA-Sequenzierungsmessungen von LV, AAo, RV und PA für eine De-novo-Annotation des O. aries-Transkriptoms gemäß den alternativen STAR-Protokollen 3 und 865 mit der NCBI-Genomassemblierung 4.0 als Vorlage zusammengefasst. Dadurch wurde der Anteil der snRNA-seq-Reads, die auf mutmaßliche intergene Regionen (dh solche, die nicht durch Massen-RNA-Sequenzierung gemessen wurden) abgebildet wurden, auf ~ 2, 5 % reduziert (Supplementary Data 4). Für weitere Analysen verwendeten wir De-novo-Transkriptomanmerkungen, einschließlich Erweiterungen der Genkoordinaten der NCBI-Genomassemblierung 4.0 und neuer offener Leserahmen (Koordinaten in Supplementary Data 5).

Einzelkern-Sequenzierungsablesungen wurden mit Cell Ranger v3 (10x Genomics) auf das De-novo-Referenztranskriptom abgebildet. Alle Proben bestanden die bioinformatische Qualitätskontrolle (Supplementary Data 4). Wir haben die Expression von 50–8.000 Genen pro Kern und weniger als 30.000 eindeutigen molekularen Identifikatoren gemessen, was beides Indikatoren für eine gute Datenqualität sind (z. B. kein Hinweis auf einen wesentlichen Beitrag von Tröpfchendubletts). Wie für Einzelkerndaten erwartet, wurde keine mitochondriale RNA nachgewiesen. Die rohen Gen-Kern-Lesezahlen wurden mit SCTransform66 normalisiert, und alle sieben Proben wurden mit den Integrationsankern von Seurat unter Verwendung der kanonischen Korrelationsanalyse integriert und mit Seurat67 geclustert, wie in der CReSCENT-Multiproben-Pipeline68 implementiert. Diese Pipeline umfasste Batch-Effektkorrektur, Datendimensionsreduzierung, Zellclusterung (Supplementary Data 6) und Visualisierung mithilfe der Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)69. Jedem Cluster wurden Zellidentitäten zugewiesen, wobei die durchschnittlichen Genexpressionsprofile für jeden Cluster mit manuell kuratierten Herzzelltypsignaturen (Supplementary Data 7) verglichen wurden, wobei die Gene Set Variation Analysis (GSVA; Supplementary Data 8)70 wie zuvor beschrieben71 verwendet wurde. Die Zellidentitäten wurden mit bekannten Markern abgeglichen. Kerne aus Cluster 7 wurden unter Verwendung derselben Zelltypsignaturen und GSVA neu geclustert und neu markiert.

Wir haben die unterschiedliche Häufigkeit von Kernen in gewickelten Proben im Vergleich zu Kontrollproben mit zwei Methoden analysiert. Zuerst haben wir die Nukleinsäurezahlen in 3 gewickelten Proben und 3 Kontrollen zusammengefasst (eine gewickelte Probe wurde wegen der viel höheren Anzahl an Fettgewebekernen im Vergleich zu den anderen ausgeschlossen; siehe unten) und einen exakten Fisher-Test (FET) der Fraktion durchgeführt jedes Zelltyps. Zweitens führten wir multinomiale logistische Regressionsanalysen mit scCODA36 und Dirichlet Reg37,38 durch. Die erste Methode scCODA ist im Theis-Labor erhältlich (https://github.com/theislab/scCODA)36. ScCoda ist eine Bayes'sche Methode und verwendet eine kontinuierliche Logit-Normal-Variante des Slab-and-Spike-Prior72 als Methode zur Variablenauswahl (Zelltyp), die nur große Faktoren identifiziert, die zur Änderung der Zellzusammensetzung beitragen. Die zweite Methode DirichletReg (https://CRAN.R-project.org/package=DirichletReg, https://epub.wu.ac.at/4077/) wurde zuvor zur Analyse der Zellzusammensetzung in Darmbiopsien von menschlichen Geschwüren verwendet colitis37 und wurde auch mit dem scCODA-Paket verglichen, sowohl auf der Preprint- als auch auf der GitHub-Site. Unser anfänglicher Fokus lag auf vier Zelltypen: Kardiomyozyten, Fibroblasten, Endothelzellen und Adipozyten. Die Probe LV_2_coiled war atypisch mit der geringsten Gesamtzahl an Zellkernen, der größten Zahl an Adipozyten und den wenigsten Kardiomyozyten. Wir haben einen konservativen Ansatz gewählt und diese Probe als wahrscheinlichen Ausreißer behandelt, der eine Region mit einer Ablagerung von Fettgewebe darstellt, und sie von Rückschlüssen auf Veränderungen in der Zellzusammensetzung ausgeschlossen, die auf Veränderungen infolge eines niedrigen linken Herzflusses zurückzuführen sein könnten.

Wir haben die snRNA-seq-Daten aller Proben in drei Verteiler aufgeteilt. Der Kardiomyozyten-Verteiler enthielt die Cluster 10, 3 und 0. Der Fibroblasten-Verteiler enthielt die Cluster 2 und 1. Der Endothel-Verteiler enthielt die Cluster 15 und 5. Anschließend filterten wir weiter Kerne im Kardiomyozyten-Verteiler, die sich nicht innerhalb des Verteilers befanden. Wir haben das UMAP mit der Funktion „DimPlot“ in Seurat V467,73 untersucht und Zellen mit UMAP_1 > 5 und UMAP_2 < 6 gefiltert. Wir haben Pseudozeit-Trajektorien mit Slingshot74 gemessen, mit Dehnung = 0 und Erweiterung = „n“. Wir verwendeten die Cluster 10, 2 und 15 als Startcluster für die Kardiomyozyten-, Fibroblasten- und Endothelcluster. Zunächst haben wir Gene entfernt, die nicht mit einem Gensymbol gekennzeichnet waren. Anschließend haben wir das Paket „tradeSeq75“ verwendet, um die Mindestanzahl geeigneter Knoten mit der Funktion „evaluateK“75 zu schätzen, bevor wir mit der Funktion „fitGAM“75 ein negativ-binomiales allgemeines additives Modell (nb-GAM) für jedes Gen angepasst haben. Bei den 5.000 variabelsten Genen wurden in jeder Erkrankung auch nb-GAMs angepasst, um Unterschiede in der Expression zwischen Erkrankungen entlang der Pseudozeit zu berücksichtigen. Mithilfe der Funktion „associationTest“75 identifizierten wir Gene, deren Expression mit Pseudozeit assoziiert ist, und mithilfe der Funktion „conditionTest“ Gene, die zwischen Bedingungen unterschiedlich exprimiert wurden. Wir haben die mit diesen Funktionen zurückgegebenen p-Werte mithilfe einer Falscherkennungsrate korrigiert (Grenzwert: FDR-bereinigter p-Wert < 0,05). Anschließend erstellten wir Pseudozeit-Heatmaps assoziierter und unterschiedlich exprimierter Gene, indem wir mithilfe der Funktion „predictSmooth“75 Smoother für jedes Gen vorhersagten. Glätter wurden skaliert und dann mit der Pheatmap-Funktion dargestellt. Wir haben die Pathway-Anreicherung dieser assoziierten und differentiell exprimierten Gene mit dem folgenden Befehl abgeschlossen:76 gprofiler(genes“,hsapiens“, ordered = TRUE, src_filter = c(“GO:BP“, „REAC“, „KEGG“), custom_bg = erkannte_Gene, Korrektur_Methode = „fdr“)77 und mit ggplot2 geplottet.

Clusterspezifische, unterschiedlich exprimierte Gene wurden zwischen Spiral- und Kontrollproben mithilfe der MAST-Methode und der Funktion „Find Markers“ im Seurat V4-Paket gemessen. Gene galten als differenziell exprimiert, wenn das Gen in mehr als 10 % der Zellen innerhalb eines Clusters nachgewiesen wurde und wenn das Gen einen FDR-bereinigten p-Wert < 0,05 aufwies. Die Signalweganreicherung differenziell exprimierter Gene wurde mit dem gProfileR R-Paket unter Verwendung des folgenden Befehls abgeschlossen: gprofiler(genes“,hsapiens“,ordered = TRUE,src_filter = c(“GO:BP“,REAC“,KEGG“), custom_bg = erkannte Gene,correction_method = „fdr“).

Wir führten eine Zellsignalisierungsanalyse mit dem CellChat R-Paket durch, indem wir den veröffentlichten Arbeitsabläufen folgten (https://github.com/sqjin/CellChat/tree/master/tutorial)78. Konkret teilen wir das Seurat-Objekt in die beiden Bedingungen „Kontrollen“ und „Coiled“ auf, bevor wir die notwendigen Daten für CellChat extrahieren, indem wir dem Tutorial „Schnittstelle mit anderen Einzelzellen-Analyse-Toolkits“ folgen. Kurz gesagt, jeder Datensatz wurde in ein CellChat-Objekt umgewandelt. Die zelluläre Kommunikation wurde mit den Funktionen „computeCommunProb“ und „filterCommunication“ anhand der Liganden-Rezeptor-Datenbank „CellChatDB.human“ geschätzt. Ligand-Rezeptor-Paare wurden mithilfe der Funktion „computeCommunProbPathway“ in Signalwegen organisiert. Cellchat-Objekte wurden zusammengeführt, bevor die gemeinsame und zustandsspezifische zelluläre Kommunikation mit einem gemeinsamen Ansatz für vielfältiges Lernen und toplogische Ähnlichkeit unter Verwendung der Funktionen „computeNetSimilarityPairwise“, „netEmbedding“ und „netClustering“ berechnet wurde. Konservierte und zustandsspezifische Signalwege wurden dann mit der Funktion „netAnalysis_signalingRole_heatmap“ visualisiert. Differenziell regulierte Ligand-Rezeptor-Paare, berechnet mit den Funktionen „identifyOverExpressedGenes“ und „netMappingDEG“ in CellChat.

Die gesamte Datenverarbeitung für Bulk-RNA-Seq, Small-RNA-Seq und snRNA-Seq wurde mit Open-Source-Statistikpaketen unter Verwendung von Standardparametern durchgeführt, sofern in den Materialien und Methoden nichts anderes angegeben ist. Nach der Datenverarbeitung wurden statistische Auswertungen im R-/4.0.0 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzdaten sind über ArrayExpress (Zugangsnummern: E-MTAB-12327 und E-MTAB-12230) und das Broad Institute (SCP1994) verfügbar. Weitere Daten sind über https://doi.org/10.6084/m9.figshare.23511888 verfügbar.

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Referenzen herunterladen

RRC wird vom Ted Rogers Center for Heart Research, der Familie Cockwell und dem Labatt Family Heart Centre unterstützt. MW wird vom Canada Research Chairs Program unterstützt. CC, LW und DS werden teilweise durch den NSERC-Zuschuss RGPIN-2019-07014 an MDW unterstützt; CC wird durch ein SickKids-RESTRACOMP-Stipendium und DS durch ein NSERC-Doktorandenstipendium unterstützt. SWS wird vom Glaxo Smith Kline-CIHR-Lehrstuhl für Genomwissenschaften an der University of Toronto und dem Hospital for Sick Children finanziert. Wir danken Dr. Timothy Regnault und Herrn Brad Matushewski für ihre Unterstützung bei der Protokollentwicklung, Schafstudien und Gewebesammlungen. Die zentrale Illustration stammt von Jannic Jaeggi.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Miriam S. Reuter, Dustin J. Sokolowski.

CGEn, The Hospital for Sick Children, Toronto, ON, Kanada

Miriam S. Reuter

Das Zentrum für angewandte Genomik, das Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

Miriam S. Reuter und Stephen W. Scherer

Genetik und Genombiologie, SickKids Research Institute, Toronto, ON, Kanada

Miriam S. Reuter, Dustin J. Sokolowski, Cadia Chan, Liangxi Wang, Stephen W. Scherer und Michael D. Wilson

Abteilung für Molekulargenetik, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Dustin J. Sokolowski, Cadia Chan, Liangxi Wang, Stephen W. Scherer und Michael D. Wilson

Princess Margaret Cancer Centre, University Health Network, Toronto, ON, Kanada

J. Javier Diaz-Mejia & Troy Cassava

Ontario Fetal Centre, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Mount Sinai Hospital, Toronto, ON, Kanada

Johannes Keunen, Greg Ryan, Edgar Jaeggi und Rajiv R. Chaturvedi

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Johannes Keunen & Greg Ryan

Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie, Western University, London, ON, Kanada

Barbra die Freiere

Children's Health Research Institute, London, ON, Kanada

Barbra die Freiere

London Health Sciences Centre, Victoria Hospital, London, ON, Kanada

Barbra die Freiere

Abteilung für pädiatrische Labormedizin, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

David A. Chiasson

Abteilung für Labormedizin und Pathobiologie, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

David A. Chiasson

McLaughlin Centre, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Stephen W. Scherer

Labatt Family Heart Centre, Abteilung für Kardiologie, Krankenhaus für kranke Kinder, Toronto, ON, Kanada

Edgar Jaeggi & Rajiv R. Chaturvedi

Abteilung für Pädiatrie, University of Toronto, Toronto, ON, Kanada

Edgar Jaeggi & Rajiv R. Chaturvedi

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RRC, JK, B.dV., GR und EJ trugen zur Konzeption bzw. Gestaltung des Werks bei. RRC, MSR, JDM, DS, CC, LW, DAC, TK, SWS und MDW trugen zur Erfassung, Analyse oder Interpretation von Daten bei. RRC und MSR haben das Manuskript verfasst. Alle Autoren haben die eingereichte Version des Manuskripts inhaltlich überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Rajiv R. Chaturvedi.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden Interessen: SWS ist Mitglied der wissenschaftlichen Beratungsausschüsse für Populationsdiagnostik und Tiefengenomik und ein häufig zitierter akademischer Berater der King Abdulaziz University. Die anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Communications Biology dankt Yifei Miao und dem anderen, anonymen Gutachter für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Kaoru Ito und Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Reuter, MS, Sokolowski, DJ, Javier Diaz-Mejia, J. et al. Ein verminderter Fluss des linken Herzens bei fötalen Lämmern führt zu einer Hypoplasie des linken Herzens und einer profibrotischen Gewebeumgestaltung. Commun Biol 6, 770 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05132-2

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Eingegangen: 04. April 2022

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 22. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05132-2

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