Ein immunstimulierendes Glykolipid, das SARS blockiert

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3959 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Prophylaktische Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 haben die Inzidenz schwerer COVID-19-Erkrankungen gesenkt, aber das Auftreten von Virusvarianten, die sich antigenisch von den Impfstämmen unterscheiden, gibt Anlass zur Sorge und zusätzliche, breit wirkende Präventionsansätze sind wünschenswert. Hier berichten wir über ein Glykolipid mit der Bezeichnung 7DW8-5, das das angeborene Immunsystem des Wirts nutzt, um eine schnelle Kontrolle viraler Infektionen in vivo zu ermöglichen. Dieses Glykolipid bindet an CD1d auf Antigen-präsentierenden Zellen und regt dadurch NKT-Zellen zur Freisetzung einer Kaskade von Zytokinen und Chemokinen an. Die intranasale Verabreichung von 7DW8-5 vor der Virusexposition blockierte die Infektion durch drei verschiedene authentische Varianten von SARS-CoV-2 sowie durch das Respiratory-Syncytial-Virus und das Influenzavirus bei Mäusen oder Hamstern erheblich. Wir fanden auch heraus, dass diese schützende antivirale Wirkung sowohl wirtsgesteuert als auch mechanismusspezifisch ist und sowohl das CD1d-Molekül als auch Interferon-\(\gamma\) erfordert. Eine chemische Verbindung wie 7DW8-5, die einfach zu verabreichen und kostengünstig herzustellen ist, könnte nicht nur bei der Verlangsamung der Ausbreitung von COVID-19 nützlich sein, sondern auch bei der Reaktion auf zukünftige Pandemien, lange bevor Impfstoffe oder Medikamente entwickelt werden.

Obwohl die COVID-19-Pandemie die Menschheit in den letzten drei Jahren verwüstet hat, war die wissenschaftliche Reaktion, Gegenmaßnahmen gegen den Erreger SARS-CoV-2 zu entwickeln und einzusetzen, wirklich beispiellos. In Rekordzeit wurde das therapeutische Arsenal um antivirale Medikamente1,2 und monoklonale Antikörper3,4 erweitert. Ebenso wurden viele prophylaktische Impfstoffe entwickelt, um die Kraft der adaptiven Immunantwort zu nutzen, wobei einige nachweislich einen hohen Schutz vor symptomatischen Infektionen bieten5,6. Da sich SARS-CoV-2 jedoch weiter ausbreitete und sich Virusvarianten weiter entwickelten, kam es häufig zu Impfdurchbruchsinfektionen, insbesondere nach dem Auftauchen der Omicron-Subvarianten, die sich antigenisch am stärksten von den Vorfahrenstämmen unterscheiden7,8. Neuartige Präventionsstrategien könnten dazu beitragen, die Übertragung dieses viralen Krankheitserregers weltweit zu verlangsamen, einschließlich Ansätzen, die das angeborene Immunsystem des Wirts ausnutzen und eine schnelle Infektionskontrolle ermöglichen. Beispielsweise zeigte sich, dass Mäuse, die vor oder kurz nach der Infektion mit einer Kombination aus inhalierten Toll-like-Rezeptor (TLR) 2/6- und 9-Agonisten (Pam2-ODN) behandelt wurden, weitgehend vor mikrobiellen Krankheitserregern, einschließlich Atemwegsviren, schützen9. Diese Wirkstoffe induzieren die Aktivierung der Antigen-präsentierenden Zellen (APC), was zur nachgeschalteten Freisetzung antiviraler Zytokine führt, die die Clearance des Virus vermitteln. Hier haben wir ein zellstimulierendes Mittel mit natürlichem Killer T (NKT) für Atemwegsvirusinfektionen evaluiert. NKT-Zellen sind eine Untergruppe von Lymphozyten, die sowohl Merkmale natürlicher Killerzellen (NK) als auch von αβ-T-Zellen besitzen10,11. Diese Zellen bilden ein Schlüsselelement der angeborenen Immunantwort und können nicht nur bei Krebs12,13,14 und Autoimmunerkrankungen15, sondern auch beim Schutz vor Infektionen16,17,18,19 eine Rolle spielen. Einige NKT-Zellen besitzen einen semi-invarianten T-Zell-Rezeptor (iTCR) und werden daher als invariante NKT-Zellen (iNKT-Zellen) bezeichnet, die bestimmte Glykolipide erkennen, die an CD1d-Moleküle auf Antigen-präsentierenden Zellen (z. B. dendritische Zellen oder DCs) gebunden sind20 und B-Zellen21, wodurch eine Kaskade von Zytokinen und Chemokinen ausgelöst wird10,11 (Abb. 1a). Es gab eine Reihe von Studien, die die Bedeutung von iNKT-Zellen gegen Virusinfektionen wie CMV, retrovirale Infektionen, RSV und Influenza22,23,24,25,26 sowie die Rolle von NKT-Zellen im Kontext adaptiver Antiviren zeigten -virale Immunantwort27,28,29,30. Der erste identifizierte CD1d-Ligand war ein Glykolipid mit der Bezeichnung α-Galactosylceramid (α-GalCer)31. Seitdem wurden bis heute mehr als ein Dutzend α-GalCer-Analoga beschrieben14,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, die alle stimulieren können iNKT-Zellen im Zusammenhang mit CD1d-Molekülen, was zur Ausübung von Aktivitäten gegen verschiedene Infektionen, Krebsarten und Autoimmunerkrankungen führt, hauptsächlich in einem Mausmodell. Aus einer fokussierten Bibliothek synthetischer Glykolipide haben wir ein α-GalCer-Analogon, 7DW8-5 (Abb. 1a), entdeckt, das im Zusammenhang mit CD1d ebenfalls iNKT-Zellen stimuliert, aber sowohl bei Maus- als auch bei menschlichem iNKT eine noch stärkere immunstimulierende Aktivität aufweist Zellen in vitro44. Bei Stimulation sezernieren iNKT-Zellen nicht nur Th1-Zytokine, die bekannte antivirale Wirkungen haben24,25,45, sondern aktivieren auch Populationen von NK-Zellen und CD8+ T-Zellen14,46,47. Jede dieser aktivierten Zellpopulationen könnte mehrere Zytokine freisetzen, darunter Interferon-γ (IFN-γ), das bekannte Schutzwirkungen gegen mehrere Virusinfektionen aufweist30,48,49.

ein Schema, das die Interaktion zwischen iNKT-Zellen, die iTCR tragen, und dendritischen Zellen (DC) zeigt, die CD1d tragen, das an das mit BioRender erstellte Glykolipid 7DW8-5 gebunden ist. Solider Schutz vor Infektionen, der sich durch die Aufrechterhaltung des Körpergewichts und die Verringerung der Viruslast (bestimmt durch Endpunkt-Verdünnungskulturen) im Lungengewebe am Tag 3 nach der Virusbelastung (d3) IN (intranasal) manifestiert, verliehen durch 7DW8-5-Verabreichung bei (b) 2 µg IV (intravenös) oder IN 2 Tage vor der Belastung [d(-2)]. c Schutz vor Infektionen durch 7DW8-5 bei Verabreichung von 2 µg IN 1 oder 2 Tage vor der Virusbelastung [d(-1) oder d(-2)] und weniger stark, wenn es 3 Tage vor der Belastung verabreicht wird [d(-3)] , aber nicht, wenn es 2 Stunden nach der Herausforderung gegeben wird [h(+2)]. (d) 0,5 oder 2 µg IN, jedoch weniger bei 0,1 µg. e Die wiederholte Gabe von 7DW8-5 (0,2 µg; IN) jeden zweiten Tag über 10 Tage (5x) verlieh einen vergleichbaren Schutz wie eine Einzeldosis 2 Tage vor der Virusbelastung (1x). f Schutz vor Infektionen durch 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 Tage vor der Belastung), nachgewiesen sowohl in der Lunge als auch in den Nasenmuscheln. Die gepunkteten Linien in den TCID50/g-Diagrammen geben die Bestimmungsgrenze der Viruslast an. Für die in (b) bis (f) gezeigten Experimente wurde in Prism v 9.3 eine nichtparametrische statistische Analyse unter Verwendung des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt, und die Ergebnisse (einschließlich Statistiken) stellen eines von zwei unabhängigen biologischen Experimenten dar. Für jedes der obigen Diagramme (b–f) ist der Mittelwert (schwarze Linie) ± SEM dargestellt. g Repräsentative 100-fache Bilder der Lunge von mit 7DW8-5 und Kochsalzlösung behandelten Mäusen vor und nach der SARS-CoV-2 MA10-Infektion. H&E in den oberen Feldern dargestellt. Die unteren Felder zeigen eine immunhistochemische (IHC)-Markierung gegen SARS-CoV-2-Nukleokapsid, gegengefärbt mit Hämatoxylin.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass die CD1d-iNKT-Zell-abhängige Wirkung von 7DW8-544,50 eine Infektion durch SARS-CoV-2, Respiratory Syncytial Virus (RSV) und Influenzavirus in Tiermodellen verhindert.

Wir haben die Hypothese getestet, dass die immunstimulierende Wirkung von 7DW8-5 die SARS-CoV-2-Infektion bei Mäusen hemmen könnte. Zunächst wurde 7DW8-5 (2 Mikrogramm (µg)) intravenös (IV) oder intranasal (IN) an Gruppen von BALB/c-Mäusen verabreicht, zwei Tage bevor jedes Tier IN mit 5 × 104 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) herausgefordert wurde der mausadaptierte MA10-Stamm51 von SARS-CoV-2. Eine dritte Gruppe von Mäusen erhielt Kochsalzlösung und diente als Kontrolle, während einer vierten Gruppe 2 Stunden nach der Virusbelastung 7DW8-5 (2 µg; IN) verabreicht wurde. Im Vergleich zu Kontrollen führten sowohl die intravenöse als auch die intravenöse Verabreichung von 7DW8-5 vor der Exposition zu einem signifikanten Schutz gegen eine MA10-Infektion, was sich in der Erhaltung des Körpergewichts und einer deutlichen Verringerung des infektiösen Virus im Lungengewebe äußerte (Abb. 1b). Eine Folgestudie wurde durchgeführt, um den Zeitpunkt der antiviralen Wirkung von 7DW8-5 (2 µg; IN) zu bestimmen. Ein starker Schutz gegen eine MA10-Infektion wurde beobachtet, wenn Mäusen dieses Glykolipid einen oder zwei Tage vor der Virusexposition verabreicht wurde, wohingegen der Schutz nur teilweise war, wenn es drei Tage zuvor verabreicht wurde (Abb. 1c). Die Verabreichung von 7DW8-5 nach der Exposition zeigte eine teilweise Schutzwirkung (Abb. 1c). Ein Dosisexperiment zeigte dann einen robusten Schutz von 7DW8-5 (IN; 2 Tage zuvor) bei Dosen von 0,5 µg oder 2 µg, wohingegen der Schutz bei einer Dosis von 0,1 µg suboptimal war (Abb. 1d).

Als nächstes untersuchten wir, ob die wiederholte Gabe von 7DW8-5 zu einer möglichen Anergie der NKT-Zellen und damit zum Verlust seiner antiviralen Wirksamkeit führen könnte. Zu diesem Zweck wurde 7DW8-5 (0,2 µg; IN) vor der MA10-Provokation 10 Tage lang jeden zweiten Tag (insgesamt fünf Dosen) einer Gruppe von Mäusen verabreicht. Als Vergleichsgruppe erhielt eine andere Gruppe von Mäusen dasselbe Glykolipid (0,2 µg; IN) nur einmal zwei Tage vor der Virusexposition. Die beobachteten Schutzwirkungen waren für beide Gruppen gleich (Abb. 1e), was auf einen Mangel an Anergie bei wiederholter Gabe von 7DW8-5 unter diesen Versuchsbedingungen hinweist. Es wurde gezeigt, dass eine intraperitoneale oder intravenöse Verabreichung einer großen Dosis (2–5 µg) eines iNKT-stimulierenden Glykolipids (α-GalCer) eine iNKT-Zellanergie induzierte, die bei Mäusen zu Reaktionslosigkeit führte52,53. Daher haben wir vor der MA10-Exposition 10 Tage lang jeden zweiten Tag eine größere Dosis (2 µg) 7DW8-5-Glykolipid intranasal an Mäusen getestet (ergänzende Abbildung 1). Obwohl der Grad der antiviralen Aktivität abnahm, könnte die wiederholte Verabreichung einer großen Dosis des Glykolipids dennoch eine schützende Wirkung entfalten. Dieser Befund wurde durch eine frühere Studie bestätigt, die zeigte, dass die intranasale, aber nicht intravenöse Verabreichung von α-GalCer eine wiederholte Stimulation natürlicher Killer-T-Zellen in der Lunge ermöglicht54. Um schließlich zu beurteilen, ob die antivirale Wirkung an der Stelle der Virusinokulation auftrat, wurde den Mäusen zwei Tage vor der MA10-Provokation erneut 7DW8-5 (2 µg; IN) verabreicht, gefolgt von der Entnahme von Nasenmuscheln und Lungen drei Tage später. In beiden Gewebesätzen von Mäusen, die mit 7DW8-5 behandelt wurden, wurde eine deutliche Verringerung der SARS-CoV-2-Infektion beobachtet (Abb. 1f).

Histopathologische Analysen der Lunge mit Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H & E) vor und nach der MA10-Provokation51 zeigten eine frühe multifokale Schädigung mit einer Ansammlung von Entzündungszellen, abgelösten Epithelzellen und Plasmaproteinen in den Atemwegslumen (Abb. 1g). Die Behandlung mit 7DW8-5 verhinderte eine solche Schädigung des Lungengewebes. Die immunhistochemische (IHC)-Färbung51,55 für SARS-CoV-2-Nukleokapsid ergab eine intensive Färbung 3 Tage nach der Infektion im Lungengewebe einer mit Kochsalzlösung behandelten und MA10-provokierten Maus, wohingegen es eine reduzierte Färbung und keine sichtbare Färbung gab das Lungengewebe von Mäusen, die mit einer Einzeldosis bzw. wiederholten Gabe von 7DW8-5 behandelt wurden (Abb. 1g). Tatsächlich reduzierte sowohl die Einzel- als auch die Mehrfachdosierung von 7DW8-5 bei der Zählung der Anzahl der infizierten Stellen die Anzahl der Stellen erheblich (ergänzende Abbildung 2), was mit der beobachteten Verringerung der Lungenvirustiter übereinstimmt (Abb. 1b – e). .

Wir haben auch die antivirale Wirkung von 7DW8-5 gegen andere SARS-CoV-2-Stämme untersucht, beginnend mit den Omicron-Subvarianten BA.1 und BA.5, die Wildtyp-Mäuse ohne vorherige Anpassung infizieren können. Dieses Infektionsmodell führte jedoch typischerweise zu keinem Gewichtsverlust bei den infizierten Tieren und zu geringeren Virusreplikationsraten56. Im Vergleich zu Kontrollen führte die Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN) 2 Tage vor der Virusbelastung (1,5 × 105 PFU) zu einer signifikanten Gewichtszunahme und einer vollständigen oder starken Hemmung der Virusreplikation im Lungengewebe (Abb. 2a, b). . Ein ähnliches Experiment wurde mit der Delta-Variante durchgeführt, die keine Wildtyp-Mäuse infizieren kann, aber K18-menschliche ACE2-transgene Mäuse sowie Hamster infizieren kann57. Erneut senkte die Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 Tage zuvor) die Viruslast sowohl im Lungen- als auch im Nasengewebe der mit dem Virus infizierten (103 PFU) transgenen K18-Human-ACE2-Mäuse deutlich (Abb. 2c). In ähnlicher Weise verringerte 7DW8-5 (100 µg/kg; IN), das zwei Tage vor der Delta-Varianten-Provokation verabreicht wurde (105 PFU), die Viruslast im Lungen- und Nasengewebe der behandelten Hamster signifikant (Abb. 2d). In beiden Experimenten war der Schutz gegen die Delta-Variante weniger robust als zuvor für MA10- oder Omicron-Subvarianten bei Wildtyp-Mäusen beobachtet, was möglicherweise auf Unterschiede in der Virusanfälligkeit der Tiermodelle zurückzuführen ist. Es ist beispielsweise bekannt, dass das hACE2-Expressionsmuster bei K18-hACE2-Tg-Mäusen unterschiedlich ist58, was sie wahrscheinlich anfälliger für Infektionen macht.

Der Umfang des durch 7DW8-5 (IN; 2 Tage zuvor) verliehenen Schutzes erstreckt sich auf die SARS-CoV-2 Omicron BA.1- und BA.5-Varianten in BALB/c-Mäusen (a, b) und die Delta-Variante in transgenen K18-Human-ACE2-Mäusen C57BL/6-Mäuse (c) oder Syrische Hamster (d) sowie gegen den RSV-A2-Stamm in BALB/c-Mäusen (e) und den Influenza-A1/H1N1/PR8-Stamm in C57BL/6-Mäusen (f, g). Die verwendete Dosis des Challenge-Virus ist oben in jedem Abbildungsfeld angegeben, und die Anzahl der verwendeten Tiere spiegelt sich in der Anzahl der Datenpunkte wider. Die den Mäusen verabreichte Dosis von 7DW8-5 betrug jeweils 2 µg, während die Dosis für Hamster 100 µg/kg betrug. In (a, b) wurde das Körpergewicht vor und am Tag 3 nach der Virusbelastung gemessen und die infektiöse Viruslast wurde 3 Tage nach der Virusbelastung bestimmt, wie dies auch für (c) sowohl für Lungen- als auch für Nasengewebe erfolgte. In (d) wurde die Viruslast 5 Tage nach der Belastung bestimmt. In (e) wurde das Körpergewicht vor und am Tag 2 nach der Virusbelastung gemessen und die Viruslast der Lunge wurde 4 Tage nach der Belastung bestimmt. In (f) wurde das Körpergewicht vor und am Tag 3 nach der Exposition gemessen und die Viruslast der Lunge wurde 3 Tage nach der Exposition bestimmt. In (g) ist ein Kaplan-Meier-Überlebensdiagramm nach einer tödlichen Influenzavirus-Provokation dargestellt. Für alle in (a) bis (f) gezeigten Experimente wurde in Prism v 9.3 eine nichtparametrische statistische Analyse unter Verwendung des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt, und die Ergebnisse (einschließlich Statistiken) stellen eines von zwei unabhängigen biologischen Experimenten dar . Der Mittelwert (schwarze Linie) ± SEM ist für jedes der obigen Diagramme (a–f) dargestellt. Die gepunkteten Linien in den TCID50/g-Diagrammen und PFU/ml-Diagrammen geben die Quantifizierungsgrenze der Viruslast an. In (g) wurde ein Log-Rank-Cox-Mantel-Test durchgeführt, um die Überlebenskurven der beiden Gruppen mit einem Hazard Ratio von 10,63 zwischen ihnen zu vergleichen.

Angesichts der Tatsache, dass 7DW8-5 in vitro keine direkte antivirale Aktivität gegen SARS-CoV-2 hatte (ergänzende Abbildung 3) und wahrscheinlich einen Teil des angeborenen Immunsystems stimulierte, untersuchten wir anschließend, ob sein Schutz auf andere klinisch wichtige Viren ausgeweitet werden könnte Erreger: RSV und Influenzavirus. Für Ersteres wurde ein RSV-A2-Stamm verwendet, von dem bekannt ist, dass er BALB/c-Mäuse infiziert59. Wie in Abb. 2e gezeigt, verhinderte die Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 Tage zuvor) den Gewichtsverlust signifikant und hemmte die Virusinfektion im Lungengewebe der behandelten Mäuse. Für die Influenza-Studien wurde der Stamm A/H1N1/PR8 verwendet, von dem bekannt ist, dass er C57BL/6-Mäuse infiziert60. Auch hier verhinderte die Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN; 2 Tage zuvor) den Körpergewichtsverlust erheblich und reduzierte die Menge an infektiösem Virus im Lungengewebe der behandelten Mäuse (Abb. 2f). In einem längerfristigen Experiment mit einer tödlichen Dosis (5 × 103 PFU) von Influenza A/H1N1/PR8 starben alle Kontrollmäuse erwartungsgemäß am 10. Tag nach der Virusexposition, während 8 von 10 Mäusen, denen 7DW8-5 verabreicht wurde, überlebten (Abb. 2g). Zusammengenommen legen die Ergebnisse in Abb. 2 nahe, dass dieses Glykolipid eine erhebliche Schutzwirkung gegen divergierende Atemwegsviren aufweist, möglicherweise aufgrund der Stimulierung eines spezifischen Immunwegs, gefolgt von einer wechselseitigen Stimulierung der iNKT-Zelle und der CD1d-exprimierenden DC-Aktivierung.

Anschließend bestimmten wir das Ausmaß der Genexpression von Zytokinen/Chemokinen im Nasenmuschelgewebe von BALB/c-Mäusen einen Tag nach der Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN) oder Kochsalzlösung. Wir haben den Durchschnitt aus drei unabhängigen Experimenten gebildet, die jeweils aus 3 BALB/c-Mäusen bestanden. IFN-γ war nach der Behandlung mit 7DW8-5 das am stärksten hochregulierte Zytokin in der Nasenmuschel (Abb. 3a). Wir haben auch das Zytokin/Chemokin-Profil in bronchoalveolärer Lavage (BAL), Homogenaten von Nasenmuscheln oder Lungen und Seren in BALB/c-Mäusen (N = 6) einen Tag nach der Verabreichung von 7DW8-5 (2 µg; IN) oder Kochsalzlösung charakterisiert . In allen untersuchten Kompartimenten der behandelten Tiere wurde eine deutliche Hochregulierung mehrerer Zytokine/Chemokine festgestellt, einschließlich IFN-γ, IL-5, IL-6, IP-10, TNF-α, MCP1 und MIG (Abb. 3b). Insbesondere IFN-γ ist ein bekanntes antivirales Zytokin61. Da berichtet wurde, dass IFN-λ auch bei Mäusen eine Aktivität gegen SARS-CoV-2 aufweist62, haben wir auch die Konzentrationen dieses Zytokins in den Überständen von Nasenmuscheln und Lungenhomogenaten sowie in Seren von mit 7DW8 behandelten Mäusen gemessen. 5 (2 µg; IN; 1 Tag vorher) oder Kochsalzlösung. Es wurden keine Hinweise auf eine IFN-λ-Induktion festgestellt (ergänzende Abbildung 4). Eine Einzelzell-RNA-Sequenzanalyse von mononukleären Lungenzellen von mit 7DW8-5 behandelten Mäusen wurde gemäß einem spezifischen Versuchsprotokoll durchgeführt (ergänzende Abbildung 5a, b), und die Expressionsniveaus repräsentativer Markergene wurden innerhalb von 18 verschiedenen Fällen dokumentiert Immunzellpopulationen (ergänzende Abbildung 5c). Die auffälligste Beobachtung ist die offensichtliche Verschiebung hin zur IFN-γ-Produktion, die in proliferierenden NK-Zellen und T-Zellen sowie in iNKT-Zellen und γδ-T-Zellen nach Exposition gegenüber 7DW8-5 beobachtet wird (Abb. 3c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass IFN-γ möglicherweise eine zentrale Rolle bei der Vermittlung der antiviralen Aktivität unseres Glykolipids spielt. Eine zusätzliche Analyse der in jeder UMAP von 7DW8-5 und Kochsalzlösung identifizierten iNKT-Zellen (Abb. 3c) kategorisierte sie basierend auf der Expression der Signaturgenmarker weiter in iNKT-Untergruppen, einschließlich iNKT1, iNKT2, iNKT17 und iNKT10, wie zuvor beschrieben63. Ein Großteil der iNKT-Zelluntergruppe, die sich 3 Tage nach der intranasalen Verabreichung (2 µg) von 7DW8-5 unter Lungen-MNCs ausgebreitet hatte, war iNKT1 (ergänzende Abbildung 6a). Daher scheint eine iNKT1-Untergruppe, die IFN-γ sezerniert, überwiegend zur Virusclearance beizutragen. Anhand unserer UMAP-Daten (Abb. 3c) haben wir auch DC-Untergruppen kategorisiert und festgestellt, dass 30 % der reifen DCs (mDCs) IL-15 unter Lungen-MNCs 3 Tage nach der intranasalen Verabreichung (2 µg) von 7DW8-5 exprimieren Ergänzende Abbildung 6b), wohingegen mDCs IL-12 konstitutiv exprimieren (Daten nicht gezeigt). Plasmazytoide DCs (pDCs) und konventionelle DCs (cDCs) exprimieren vor und nach der 7DW8-5-Behandlung eine minimale Menge an IL-12 (Daten nicht gezeigt).

eine Heatmap, die die unterschiedliche Expression der Gene (wie angegeben) in Nasenmuscheln (NT) zeigt, was einem Durchschnitt von drei unabhängigen Experimenten entspricht, wobei jedes aus einer Gruppe von 3 BALB/c-Mäusen 24 Stunden nach 7DW8-5 (2 µg) besteht. oder Kochsalzlösung durch IN. Der Maßstabsbalken zeigt den durchschnittlichen Z-Score. b Induktion von Zytokinen/Chemokinen in bronchoalveolärer Lavage (BAL), Überständen von Homogenaten der Lunge (LH) und Nasenmuscheln (NT) und Seren 24 Stunden nach der Verabreichung von 7DW8-5 an Mäuse (N = 6), wie anhand der Maus beurteilt Cytokine Array/Chemokine Array 31-Plex (MD31) Plattform (Eve Technologies). Die Zytokinkonzentrationen werden aufgetragen (in Kreisen) und Durchschnittswerte angezeigt (unter Verwendung von Balkendiagrammen), und die bei der Behandlung mit 7DW8-5 beobachtete fache Änderung wird oben ausgedrückt. c Verschiebung hin zu IFN-\(\gamma\)-produzierenden Zellen, dargestellt durch Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) von insgesamt 27.532 einzelnen CD45+-Zellen aus der Lunge von 3 BALB/c-Mäusen 24 Stunden nach der Behandlung mit 7DW8-5 oder Kochsalzlösung (siehe auch ergänzende Abbildung 5a). Die UMAP wurde in 15.397 Einzelzellen (7DW8-5, links) und 12.135 Einzelzellen (Kochsalzlösung, rechts) aufgeteilt. Jeder Cluster (wie angegeben) wurde durch unbeaufsichtigtes Clustering identifiziert und separat eingefärbt. iNKT-Zellen wurden anhand der Expression des semiinvarianten TCR Vα14-Jα18 identifiziert.

Der letzte Teil dieser Studie befasste sich mit dem Schutzmechanismus für 7DW8-5. Zunächst wurde die Rolle der CD1d-vermittelten Aktivierung untersucht, indem 7DW8-5 mit seiner aktiven Ausgangsverbindung, α-GalCer, und mit 1:18 Caproylamin PE verglichen wurde, von dem bekannt ist, dass es aufgrund des Fehlens an CD1d bindet, ohne iNKT-Zellen zu stimulieren eine Zuckereinheit (Ergänzende Abbildung 7)44,64. Sowohl die Verabreichung von 7DW8-5 als auch von α-GalCer (0,1 µg; IN; 2 Tage zuvor) führte zu einem Schutz. Es gibt jedoch einen signifikanten Unterschied in der Viruslast der Lunge zwischen den Mäusen, die α-GalCer erhielten, und den Mäusen, die 7DW8-5 nach MA10-Exposition erhielten (Abb. 4a). Die Verabreichung von 1:18 Caproylamin PE in einer viel höheren Dosis (2 µg; IN) brachte keinen Schutz. Dieser Befund führte zu einem anschließenden Experiment mit CD1d-Knockout-Mäusen (KO). Tatsächlich wurde die bei Wildtyp-Mäusen beobachtete Schutzwirkung von 7DW8-5 gegen die SARS-CoV-2-MA10-Exposition bei CD1d-KO-Mäusen vollständig aufgehoben (Abb. 4b), was die unverzichtbare Rolle der CD1d-Aktivierung bei der antiviralen Aktivität von 7DW8 zeigt -5.

a 7DW8-5 (0,1 µg; IN) und α-GalCer (0,1 µg; IN) üben in geringerem Maße eine Schutzwirkung gegen SARS-CoV-2 bei BALB/c-Mäusen aus, wenn sie 2 Tage vor der intranasalen Belastung mit 50.000 PFU davon verabreicht werden Stamm MA10. Der Schutz basierte auf Veränderungen des Körpergewichts und der infektiösen Viruslast im Lungengewebe am Tag 3 nach der Virusexposition. Die Schutzwirkung von 7DW8-5 ist bei CD1d-KO BALB/c-Mäusen (b) oder IFN-\(\gamma\)-KO C57BL/6-Mäusen (c) aufgehoben. d Die bei Wildtyp-Mäusen beobachtete Schutzwirkung von 7DW8-5 geht bei Vorbehandlung mit einem blockierenden monoklonalen Anti-Maus-IFN-\(\gamma\)-Antikörper (XMG 1,2 bei 0,5 mg) verloren, bleibt aber bei intraperitonealer Vorbehandlung erhalten. Behandlung mit einem monoklonalen Maus-IgG1-Isotyp-kontrollierenden Antikörper (0,5 mg). 2 µg 7DW8-5 wurden jedem in (b–d) verwendeten Tier dosiert. Für alle in (a) bis (d) gezeigten Experimente wurde in Prism v 9.3 eine nichtparametrische statistische Analyse unter Verwendung des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests durchgeführt, und die Ergebnisse (einschließlich Statistiken) stellen eines von zwei unabhängigen biologischen Experimenten dar. Für jedes der obigen Diagramme ist der Mittelwert (schwarze Linie) ± SEM dargestellt. Die gepunkteten Linien in den TCID50/g-Diagrammen geben die Bestimmungsgrenze der Viruslast an.

Als nächstes bestimmten wir die Rolle, die IFN-γ bei der biologischen Aktivität von 7DW8-5 spielt, indem wir Schutzstudien an Mäusen mit IFN-γ-Mangel durchführten. Wieder einmal ging die bei Wildtyp-Mäusen beobachtete antivirale Aktivität von 7DW8-5 gegen die SARS-CoV-2-MA10-Exposition bei IFN-γ-KO-Mäusen vollständig verloren (Abb. 4c). Darüber hinaus wurde die Anti-SARS-CoV-2-Wirkung von 7DW8-5 bei Wildtyp-Mäusen durch die intraperitoneale Injektion eines blockierenden monoklonalen Anti-Maus-IFN-γ-Antikörpers vor der Glykolipidbehandlung weitgehend eliminiert (Abb. 4d). Diese letztgenannten Ergebnisse belegen, dass IFN-γ neben CD1d ein weiterer wesentlicher Mediator der Aktivität von 7DW8-5 ist.

Die nächste bevorstehende Frage betrifft die Übertragbarkeit unserer Erkenntnisse aus Kleintiermodellen auf den Menschen. Es ist bekannt, dass das CD1d-Molekül zwischen Menschen und Mäusen stark konserviert ist20. Tatsächlich war 7DW8-5 in der Lage, primäre humane CD161highTCRVα24+ NKT-Zellen merklich zur Sekretion von IFN-γ in vitro zu stimulieren (ergänzende Abbildung 8a – c). Am wichtigsten ist, dass wir herausfanden, dass die Überstände menschlicher iNKT-Zelllinien, die mit CD1d-transfizierten Hela-Zellen in Gegenwart von 7DW8-5, jedoch nicht von PE, stimuliert wurden, die ic-SARS-CoV-2-mNeonGreen65-Infektion in Huh7 signifikant hemmen konnten Zellen in vitro66, und dass diese Hemmung vollständig aufgehoben wurde, als der Kultur neutralisierender Anti-Human-IFN-γ-Ab zugesetzt wurde (ergänzende Abbildung 8d). Alle diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass IFN-γ eine bedeutende Rolle bei der Vermittlung der Anti-SARS-CoV-2-Aktivität durch 7DW8-5 sowohl bei Mäusen als auch beim Menschen spielt.

Wir haben herausgefunden, dass die intranasale Verabreichung von 7DW8-5, einem immunstimulierenden Glykolipid, als Präexpositionsprophylaxe bei der Blockierung der SARS-CoV-2-Infektion bei Wildtyp-Mäusen gut funktionierte, wie durch die Aufrechterhaltung des Körpergewichts und eine Reduzierung des Virus um >2 log gezeigt wurde Replikation in der Lunge (Abb. 1b–f) sowie durch die deutliche Reduktion des viralen Nukleokapsidproteins im Lungengewebe (Abb. 1g). Die Viruslast in den Nasenmuscheln wurde ebenfalls um das etwa 50-fache reduziert (Abb. 1f), was mehr ist als die Blockade, die mit monoklonalen Antikörpern in diesem Gewebekompartiment beobachtet wurde67. Die Verabreichung von 7DW8-5 nach der Exposition war jedoch unwirksam (Abb. 1c), was darauf hindeutet, dass dieses Glykolipid als Therapeutikum nicht nützlich sein wird, möglicherweise weil seine immunstimulierenden Wirkungen einen ausreichenden Vorsprung benötigen, um ein sich schnell replizierendes Virus zu verlangsamen. Wir haben auch gezeigt, dass sich der durch 7DW8-5 verliehene Schutz auf drei authentische SARS-CoV-2-Varianten erstreckt, darunter die Omicron-Subvarianten BA.1 und BA.5 in Wildtyp-Mäusen (Abb. 2a, b) und die Delta-Variante in K18 transgene human-ACE2-Mäuse und Hamster (Abb. 2c und 2d). Darüber hinaus wurde eine vergleichbare antivirale Aktivität bei Mäusen nach Belastung mit RSV (Abb. 2e) oder Influenzavirus (Abb. 2f, g) beobachtet. Insgesamt belegen diese Ergebnisse die Breite des Schutzes von 7DW8-5 im Vergleich zu drei Familien von Atemwegsviren (Coronaviren, Paramyxoviren und Orthomyxoviren), von denen jede nicht nur klinisch wichtig ist, sondern auch pandemisches Potenzial hat.

Das übergeordnete Glykolipid, α-GalCer, ist ein starker Aktivator von iNKT-Zellen und induziert die Produktion großer Mengen an IFN-γ, das sowohl CD8+-T-Zellen als auch Antigen-präsentierende Zellen (APCs) wie DCs, Makrophagen usw. aktiviert B-Zellen46. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Wirkung von 7DW8-5 auch von CD1d- und iNKT-Zellen abhängt44. Es ist bemerkenswert, dass 7DW8-5 bei Verabreichung einer kleinen Dosis (0,1 µg) 7DW8-5 oder α-GalCer an Mäuse und anschließender MA10-Exposition eine deutlich stärkere antivirale Wirkung ausübte, was zu einer stärker verringerten Viruslast in der Lunge führte ( Abb. 4a). Während viele Zytokine/Chemokine durch dieses Glykolipid induziert wurden (Abb. 3a, b), wurde seine antivirale Wirkung bei CD1d-KO-Mäusen vollständig aufgehoben (Abb. 4b), was erwartet wurde, da 7DW8-5 für eine optimale Bindung und Auslösung ausgewählt wurde sowohl durch menschliches als auch durch Maus-CD1d (Abb. 1a)44. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Schutzwirkung IFN-γ ist, ein Molekül im angeborenen Immunsystem, von dem bekannt ist, dass es breite antimikrobielle Aktivitäten besitzt61. Tatsächlich zeigte 7DW8-5 bei IFN-γ-KO-Mäusen überhaupt keinen Schutz (Abb. 4c), und seine Schutzwirkung bei Wildtyp-Mäusen ging weitgehend verloren, wenn eine Vorbehandlung mit einem blockierenden monoklonalen Anti-IFN-γ-Antikörper durchgeführt wurde gegeben (Abb. 4d). Daher sind sowohl CD1d als auch IFN-γ für die Aktivität von 7DW8-5 in vivo notwendig; Es bleibt jedoch unklar, ob beide ausreichend sind, da möglicherweise wichtige Mediatoren stromabwärts von IFN-γ vorhanden sind.

Wir sind davon überzeugt, dass 7DW8-5 als Mittel zur Präexpositionsprophylaxe zur Vorbeugung von Infektionen durch SARS-CoV-2, RSV, Influenzaviren und möglicherweise andere klinisch wichtige Atemwegsviren vielversprechend ist. Auch sein potenzieller Nutzen für künftige Viruspandemien ist uns nicht entgangen. Es handelt sich um eine chemische Verbindung, die thermostabil ist und daher einfach zu transportieren und zu lagern, kostengünstig herzustellen und leicht intranasal zu verabreichen ist. Angesichts unserer kollektiven Erfahrungen mit der COVID-19-Pandemie fällt es niemandem schwer, sich zahlreiche Alltagssituationen vorzustellen, in denen mit hochriskanten Expositionen zu rechnen ist und in denen, sofern verfügbar, eine wirksame Präventivmaßnahme ergriffen werden kann. Aber wären die hier berichteten Ergebnisse von Nagetieren auf den Menschen übertragbar? Eine endgültige Antwort könnte nur durch die Durchführung klinischer Studien gegeben werden, es besteht jedoch die begründete Erwartung, dass 7DW8-5 bei Menschen ähnlich wirksam sein könnte. Zunächst haben wir dieses Glykolipid aus einer Bibliothek von Analoga ausgewählt, basierend auf seiner starken stimulierenden Wirkung auf menschliche iNKT-Zellen in vitro44. 7DW8-5 zeigte eine 80-mal höhere Bindungsaffinität zu menschlichem CD1d als α-GalCer und übte im Vergleich zu α-GalCer eine 140-mal höhere dosissparende Wirkung auf menschliche iNKT-Zellen aus. Zweitens machen iNKT-Zellen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bis zu 1 % der mononukleären Zellen des peripheren Blutes aus68,69, obwohl die Variabilität bei Menschen größer ist68. Schließlich haben wir in dieser Studie gezeigt, dass der Überstand menschlicher iNKT-Zellen, die durch 7DW8-5 aktiviert wurden, in vitro eine antivirale Aktivität zeigen kann und dass die Aktivität durch antihumane IFN-γ-Antikörper gehemmt wird (ergänzende Abbildung 8).

Viele Herausforderungen müssen überwunden werden, bevor 7DW8-5 als Kandidat für die klinische Entwicklung in Betracht gezogen werden kann. An erster Stelle stehen dabei die Sicherheit und Verträglichkeit, da die Induktion von Zytokinen wie TNF-α und IL-6 (Abb. 3a, b) zu einer übersteigerten Entzündungsreaktion führen könnte. Daher sind formelle Sicherheits-/Toxizitätsstudien an zwei oder mehr Tierarten erforderlich. Mehrere Beobachtungen gehen jedoch auf dieses Problem ein. Frühere klinische Studien70,71,72,73 mit dem Ausgangsglykolipid α-GalCer zeigten bei Verabreichung (6 intravenöse Dosen von 0,12 mg/kg) an Krebspatienten keine Hinweise auf Toxizität70. In einer Impfstoff-Adjuvans-Studie an Rhesusaffen führten bis zu 100 µg 7DW8-5 intramuskulär zu keinen Nebenwirkungen74, ähnlich dem Mangel an Toxizität, der bei Mäusen und Hamstern in der aktuellen Studie festgestellt wurde. Dennoch werden auch zusätzliche Studien zu 7DW8-5 notwendig sein, um die Dauer seiner prophylaktischen Wirkung einzugrenzen, seine optimale Dosis genauer zu bestimmen und bei wiederholter Anwendung über einen längeren Zeitraum nach Anzeichen einer Anergie zu suchen.

Aktuelle COVID-19-Impfstoffe haben die Auswirkungen der Pandemie abgemildert, indem sie symptomatische Infektionen, Krankenhausaufenthalte und Todesfälle verringert haben. Die einst weit verbreitete übermäßige Angst ist durch die Entwicklung dieser Impfstoffe und wirksamer Behandlungen weitgehend verschwunden. Da sich SARS-CoV-2 jedoch weiterhin antigenisch weiterentwickelt75, kommt es häufig zu Durchbruchsinfektionen76, die zumindest zu erheblichen Störungen unseres täglichen Lebens führen. Daher sind zusätzliche Präventionsmodalitäten erforderlich. Sollte sich 7DW8-5 als sicher erweisen, könnte es ein weiteres Instrument in unserem Kampf gegen COVID-19 und andere Atemwegsvirusinfektionen sein, was ebenfalls zu einem enormen wirtschaftlichen Verlust führen würde. Die Stärke des CD1d-Agonisten würde in der schnellen Reaktion auf unbekannte neu auftretende Virusinfektionen liegen, während Impfstoffe und andere virusspezifische Ansätze noch untersucht werden. In diesem Zusammenhang besteht auch die Möglichkeit einer alternativen Verwendung von 7DW8-5-Glykolipid als Impfstoffadjuvans74. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses immunstimulierende Glykolipid mit verschiedenen Strategien in der Praxis eingesetzt werden könnte, um auf zukünftige Ausbrüche oder Pandemien zu reagieren, die durch ein neu auftretendes Atemwegsvirus verursacht werden, und zwar vor und während der Entwicklung von Medikamenten und Impfstoffen.

Eine Leistungsanalyse auf der Grundlage der Richtlinien des Institute for Laboratory Animal Research wurde verwendet, um die Probengröße vorab zu bestimmen und die Mindestanzahl an Tieren abzuschätzen, die erforderlich ist, um eine signifikante Wirkung von 7DW8-5-Glykolipid festzustellen, sofern eine solche nachgewiesen wird. Die Experimente waren nicht randomisiert und die Forscher waren hinsichtlich der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind.

Menschliche mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) von anonymen Blutspendern wurden aus Leukopacks gewonnen, die vom New York Blood Center (NYBC) bereitgestellt wurden. Die NYBC wählt Spender nicht nach Geschlecht oder Rasse aus, sondern stellt sicher, dass alle Spender über 18 Jahre alt sind. Daher war für die von uns durchgeführten Arbeiten keine Genehmigung durch das Institutional Review Board erforderlich. Alle Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit der Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals des United States Public Health Service durchgeführt. Das Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Columbia University (Animal Welfare Assurance Nr. D16-00003) und der Washington University School of Medicine (Animal Welfare Assurance Nr. A3381–01) genehmigt. Die Virusimpfungen wurden unter Narkose durchgeführt, die mit Ketaminhydrochlorid und Xylazin eingeleitet und aufrechterhalten wurde, und es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren. Mäuse und Hamster wurden mit CO2 eingeschläfert, wobei alle Anstrengungen unternommen wurden, um das Leiden zu minimieren.

Weibliche BALB/c-Mäuse im Alter von 10–15 Wochen und weibliche C57BL/6-Mäuse im Alter von 14–15 Wochen sowie weibliche BALB/c-Mäuse ohne CD1d1- und CD1d2-Gene (Stamm: C.129S2-Cd1tm1Gru/J) und weibliche C57BL/6-Mäuse ohne IFN-\(\gamma\) (Stamm: B6.129S7-Ifngtm1Ts/J) wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) gekauft und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in der Tierhaltung gehalten am Columbia University Irving Medical Center. Heterozygote 8–9 Wochen alte weibliche K18-hACE C57BL/6J-Mäuse (Stamm: 2B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J) wurden vom Jackson Laboratory bezogen und in einer pathogenfreien Tierhaltung an der Washington University School gehalten der Medizin. Männliche syrische Hamster im Alter von 5 bis 6 Wochen wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) gekauft und in einer Einrichtung der erhöhten Biosicherheitsstufe 3 (BL3) an der Washington University in St. Louis untergebracht.

Glykolipid 7DW8-5 mit der chemischen Formel [(2S,3S,4R)-1-O-(α-D-galactopyranosyl)-N-(11-(4-fluorphenyl)undecanoyl)-2-amino-1,3,4 -Octadecantriol)] wurde wie zuvor beschrieben synthetisiert44. Glykolipid α-Galactosylceramid (α-GalCer) mit der chemischen Formel [N-[(3S,4R)-3,4-dihydroxy-1-[(2S,3R,4S,5R,6R)-3,4,5- Trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoctadecan-2-yl]hexacosanamid] und Kontrolllipide mit der chemischen Formel 18:1 Caproylamin PE [1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-( Hexanoylamin)] und 18:1 Biotinyl-PE [1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(biotinyl)-Natriumsalz] wurden von Avanti Polar Lipids bezogen.

Vero-E6- (ATCC Cat #1586) und Vero-TMPRSS2-ACE2-Zellen (Geschenk der Emory University) wurden bei 37 °C in Dulbecco's Modified Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS), 10 mM HEPES, kultiviert pH 7,3 und 100 U/ml Penicillin-Streptomycin. Huh7, eine menschliche Hepatokarzinomzelllinie, wurde von der Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB0403) erworben und unter den gleichen Bedingungen wie Vero-E6-Zellen kultiviert. Die Viren SARS-CoV-2 MA10, Delta-Variante (B.1.617.2) und Omicron-Varianten, BA.1 und BA.5, wurden von BEI (Kat.-Nr. NR-55329, NR-55691, NR-56475 und NR -58616). Omicron-Stamm wurde wie beschrieben in Vero-TMPRSS2-Zellen vermehrt, während andere SARS-CoV-2-Isolate für diese Studie wie beschrieben in Vero-E6-Zellen vermehrt wurden77. Der infektiöse Klon ic-SARS-CoV-2, WA1/mNeonGreen wurde vom World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA) an der University of Texas Medical Branch bezogen und vor der Verwendung in Vero-E6-Zellen vermehrt und titriert. Alle Arbeiten mit infektiösem SARS-CoV-2 wurden in zugelassenen BSL3- und A-BSL3-Einrichtungen am Columbia University Irving Medical Center oder an der Washington University unter Verwendung geeigneter Überdruck-Atemschutzgeräte und Schutzausrüstung durchgeführt. Madin-Darby Canine Kidney (MDCK)-Zellen (Kat.-Nr. CCL-34) und HEp-2-Zellen (Kat.-Nr. CCL-23) wurden von der ATCC erworben. Influenza-A-Virus (H1N1) PR/8/34-Stamm (Kat.-Nr. VR-95) und humanes Respiratory-Syncytial-Virus (RSV)-A2-Isolat (Kat.-Nr. VR-26PQ), erworben von ATCC, wurden vermehrt und in MDCK und Hep-2 titriert Zellen bzw. unter BSL2-Bedingung. Von ATCC gekaufte Hep-2-Zellen (Kat.-Nr. CCL-23) wurden vom International Cell Line Authentication Committee als Zelllinie registriert, die durch HeLa-Kontamination entsteht, aber zuvor im Labor für die Vermehrung von (RSV) A2-Isolat validiert wurde zu Titrationsexperimenten.

Nasenmuscheln wurden Mäusen wie beschrieben entnommen78. Kurz gesagt, die Haut wurde präpariert und vollständig vom Schädel und der Nase entfernt, und der Schädel wurde in der koronalen Ebene geschnitten. Anschließend wurde der Rest des Vorderschädels entfernt. Nach der Entfernung des hinteren Teils der Schädelbasis wurde die Schere in die hintere Nasenhöhle eingeführt. Anschließend wurde die Nahtlinie beidseitig eingeschnitten, wodurch die Nasenscheidewand freigelegt wurde. Die Schere trennte die beiden Oberkieferknochen (lateral) und das Siebbein (medial) entlang der deutlichen Nahtlinie. Schließlich wurden der obere Gaumen und die vordere Nasenspitze entfernt, um die Präparation abzuschließen. Für die Nasenmuschel von Hamstern wurde die Nasenmuschel entnommen, indem zunächst die Haut an der Seite der Nase und der Wangen entfernt wurde. Anschließend wurde der Kiefer aufgeschnitten, wodurch der Gaumen des Hamsters freigelegt wurde. Es wurde ein sagittaler Einschnitt durch den Gaumen vorgenommen, um die Nasenmuschel freizulegen, die mit einer stumpfen Pinzette entfernt wurde. Die Nasenmuschel wurde in 1 ml DMEM, ergänzt mit 2 % FBS, L-Glutamin und 1 % HEPES, homogenisiert. Das Homogenat wurde 5 Minuten lang bei 1000 g zentrifugiert. Das gesamte Lungengewebe wurde nach der Trennung von Bronchien und anderem Nicht-Lungengewebe gewogen, in ein BioMasher II-Röhrchen (Diagnocine LLC) mit 250 µL DMEM-Medium, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS, gegeben und manuell durch Hin- und Herdrehen des Mahlwerks homogenisiert bis das gesamte Gewebe vollständig homogenisiert war. Anschließend wurden die Gewebehomogenate in den Röhrchen 10 Minuten lang bei 1000 g und 4–10 °C zentrifugiert. Sowohl für Nasenmuscheln als auch für Lungenhomogenate wurde der Überstand gesammelt und zur Erkennung des Virustiters und der Viruslast bei –80 °C gelagert.

Lungen- und Nasenmuschelhomogenate von mit 7DW8-5 oder Kochsalzlösung behandelten und gereizten Mäusen und Hamstern, die in der ABSL3-Einrichtung gesammelt wurden, wurden zur Einrichtung des TCID50-Titrationstests verwendet. Serielle 2-fache Verdünnungen der Proben wurden zu einer 96-Well-Platte gegeben, die mit 2 × 104 Vero-E6-Zellen bei 37 °C und 5 % CO277 besiedelt war. Drei Tage später wurden die Vertiefungen visuell auf den zytopathischen Effekt (CPE, wie durch Lichtmikroskopie beobachtet) der Zellen bei jeder Verdünnung bewertet, um den Endpunkt TCID zu bestimmen. Für den PFU-Assay wurden Vero-TMPRSS2-ACE2-Zellen mit einer Dichte von 1,25 × 105 Zellen/Well in Gewebekulturplatten mit flachem Boden und 24 Wells ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Medien durch 200 Mikroliter 10-facher Serienverdünnungen der Probe, verdünnt in DMEM + 2 % FBS, ersetzt. Eine Stunde später wurde 1 ml Methylcellulose-Overlay hinzugefügt. Die Platten wurden 72 Stunden lang inkubiert und dann 1 Stunde lang mit 4 % Paraformaldehyd (Endkonzentration) in PBS fixiert. Die Platten wurden mit 0,05 % (Gew./Vol.) Kristallviolett in 20 % Methanol gefärbt und zweimal mit destilliertem, entionisiertem Wasser gewaschen. Die Plaques wurden gezählt und die Titer nach einer zuvor beschriebenen Methode79 berechnet.

Für die RSV-Titration wurden Lungenhomogenate von mit Kochsalzlösung oder 7DW8-5 behandelten und provozierten Mäusen seriell um das Vierfache verdünnt und auf eine konfluente Schicht aus Hep-2-Zellen gelegt59. Ein Viruskontrollstandard des zur Infektion der Mäuse verwendeten A2-Isolats wurde ebenfalls seriell verdünnt und parallel laufen gelassen, um den resultierenden CPE zu vergleichen. Infizierte Zellen und Kontrollzellen wurden 5 Tage lang bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Bei jeder Verdünnung wurde virales CPE unter dem Mikroskop beobachtet. Mithilfe der Endpunktverdünnungsmethode wurde der TCID50 pro Behandlungsgruppe berechnet.

Für die Influenza-PR8-Virustitration wurden Lungenhomogenate von mit Kochsalzlösung oder 7DW8-5 behandelten Mäusen am Tag 5 nach der Belastung mit 200 PFU PR8/A/34-Virus pro Maus geerntet. Homogenate wurden seriell um das Dreifache verdünnt und auf eine konfluente Schicht aus Martin-Delaney-Canine-Nierenzellen (MDCK) gelegt. Das PR8/A/34-Isolat wurde ebenfalls seriell verdünnt und als Positivkontrolle verwendet. Die Zellen wurden bei 33 °C/5 % CO2 inkubiert und die Überstände nach 72 Stunden gesammelt, um die Aktivität der viralen Neuraminidase aus jeder Vertiefung mithilfe eines Fluoreszenztests80,81 mit dem NA-Fluor Influenza Neuraminidase Assay Kit (Applied Biosystems) zu bestimmen. Die Produktion des fluorogenen Produkts 4-Methylumbelliferon wurde in einem Spectramax i3X-Mikroplattenlesegerät unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 450 nm abgelesen. Negativkontrollen mit nicht infizierten Zellüberständen dienen als Leerwert für den Test. Fluoreszenzdaten wurden mit der Software Softmax Pro 7.0.2 erfasst. Der Endpunkt für jede Probe wurde als 3-facher oder höherer Anstieg der Neuraminidase-Aktivität im Vergleich zu den Kontrollen berechnet. TCID/g Lunge wurde für jede Probe berechnet und mit GraphPad Prism v9.3 aufgezeichnet.

Histologische und immunhistochemische Tests wurden wie beschrieben durchgeführt51,55. Unmittelbar nach der Euthanasie wurde der linke Lungenlappen entnommen und durch Eintauchen in 10 % phosphatgepuffertes Formalin über Nacht und anschließendes Eintauchen in 70 % Ethanol für bis zu eine Woche fixiert, was ausreichte, um die Viren zu desinfizieren. Fixiertes Gewebe wurde manuell in Paraffin eingebettet und Schnitte mit einer Dicke von 4 µm hergestellt. Gewebeschnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (Richard Allan Scientific, San Diego, CA) gefärbt. Für die Immunhistochemie wurde die Antigengewinnung mit einer Antigen-Demaskierungslösung (pH 6,0 Citratpuffer, H-3300, Vector Laboratories, Newark, CA) durchgeführt, gefolgt von einer Peroxid-Inkubation. Die Gewebeschnitte wurden zunächst über Nacht mit dem primären Antikörper, dem SARS-CoV-2-Nukleokapsidprotein-Kaninchen-mAb (26369, Cell Signaling, Danvers, MA) und dann mit dem sekundären Antikörper, dem HRP-konjugierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (MP7401, Vector,) inkubiert Labore). Das Signal wurde dann mit einem DAB-Färbekit (NC9567138, Fisher Scientific, Waltham, MA) verstärkt und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Schließlich wurden die Gewebe mit einem Aperio AT2-Objektträgerscanner (Leica Biosystems, Deer Park, IL) kachelgescannt und die Bilder mit einem Aperio ImageScope (Leica Biosystems, Deer Park, IL) aufgenommen.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem miRNeasy Micro Kit (Qiagen, 217084) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Nasenmuscheln isoliert. Das ERCC RNA Spike-In Mix Kit (ThermoFisher Scientific, 4456740) wurde der normalisierten Gesamt-RNA vor der Bibliotheksvorbereitung gemäß dem Protokoll des Herstellers zugesetzt. Die RNA-Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit für Illumina gemäß den Anweisungen des Herstellers (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) vorbereitet. Die Proben wurden mit dem Illumina HiSeq-Instrument gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung einer 2x150bp Paired End (PE)-Konfiguration sequenziert. Nach der strengen Qualitätskontrolle der Rohdaten wurden die Sequenzablesungen mithilfe von Trimmomatic v.0.36 gekürzt, um mögliche Adaptersequenzen und Nukleotide mit schlechter Qualität zu entfernen. Die getrimmten Lesevorgänge wurden mithilfe des STAR-Aligners v.2.5.2b auf das auf ENSEMBL verfügbare Mus-musculus-Referenzgenom abgebildet. Als Ergebnis dieses Schritts wurden BAM-Dateien generiert. Die Anzahl der eindeutigen Gentreffer wurde mithilfe von Feature Counts aus dem Subread-Paket v.1.5.2 berechnet. Es wurden nur eindeutige Lesevorgänge gezählt, die innerhalb der Exon-Regionen lagen. Nach der Extraktion der Gen-Hit-Zählungen wurde die Gen-Treffer-Zählungstabelle für die nachgelagerte Analyse der differentiellen Expression verwendet. Mithilfe von DESeq2 wurde ein Vergleich der Genexpression zwischen den Probengruppen durchgeführt.

Zur IFN-\(\gamma\)-Neutralisierung wurde den Mäusen durch intraperitoneale Injektion ein Anti-Maus-IFN-\(\gamma\)-Antikörper (BioXCell; Klon XMG1.2) oder eine Ratten-IgG1-Isotypkontrolle (BioXCell; Klon HRPN) verabreicht am Tag -1 (0,5 mg) und Tag 0 (0,5 mg) im Vergleich zur MA10-Inokulation.

Bronchoalveoläre Lavage (BAL) wurde wie beschrieben entnommen82. Kurz gesagt, nachdem die Maus eingeschläfert worden war, wurde das Tier auf dem Rücken auf eine chirurgische Platte gelegt. Nachdem mit einem Skalpell ein Einschnitt in die Halshaut in der Nähe der Luftröhre vorgenommen wurde, wurde die vom Sternohyoideusmuskel umgebene Luftröhre freigelegt. Nachdem mit einer Zange ein Baumwollfaden unter die Luftröhre gelegt wurde, wurde die Mitte der freigelegten Luftröhre zwischen zwei Knorpelringen vorsichtig mit einer 26-G-Nadel punktiert. Dann wurde der etwa 0,5 cm lange Katheter in die Luftröhre eingeführt und stabilisiert, indem die Luftröhre mithilfe des platzierten Baumwollfadens um den Katheter gebunden wurde. Eine 1-ml-Spritze mit 1 ml steriler ausgewogener Salzlösung mit 100 μM EDTA wurde an den Katheter angeschlossen und die Salz/EDTA-Lösung vorsichtig in den Katheter injiziert. Die Lösung wurde dann vorsichtig abgesaugt, während der Brustkorb der Maus massiert wurde. Die Spritze wurde von der Nadel entfernt und die gewonnene Spülflüssigkeit in ein auf Eis gestelltes 15-ml-Röhrchen überführt.

Seren und Überstände wurden durch Zentrifugation von Nasenmuscheln (NT), bronchioalveolärer Lavage (BAL) und Lungenhomogenaten (LH) von Mäusen gesammelt, die einen Tag zuvor mit 7DW8-5 behandelt worden waren. Seren und Überstände wurden auch von Mäusen gesammelt, die einen Tag zuvor mit Kochsalzlösung behandelt worden waren. Die Seren und Überstände wurden von Eve Technologies Corporation (Calgary, AB, Kanada) unter Verwendung ihres Mouse Cytokine/Chemokine 31-Plex Array (MD31) auf Zytokine und Chemokine analysiert.

Mononukleäre Lungenzellen (MNCs) wurden wie beschrieben geerntet83. Wie in der ergänzenden Abbildung 5a gezeigt, wurden die Lungen zunächst mit PBS perfundiert, das Kollagenase IV und DNase1 enthielt. Einzelzellsuspensionen wurden durch mechanische Dissoziation von Lungengewebe durch ein 70-μm-Nylonnetz hergestellt, anschließend auf Ficoll-Paque (Sigma) geschichtet und 20 Minuten lang bei 900 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem Sammeln von Lungen-MNC aus der Gradienten-Interphase wurden die Zellen mit Anti-Maus-Fc-Rezeptor-Antikörper (BioLegend, Kat.-Nr. 101320) inkubiert, um die unspezifische Antikörperbindung zu blockieren. Jede Probe wurde dann 30 Minuten lang mit Phycoerythrin-markiertem Anti-Maus-CD45-Antikörper (BioLegend, Kat.-Nr. 103106) gefärbt. Unmittelbar vor dem Sortieren der Zellen wurde DAPI (10.000-fache Verdünnung) hinzugefügt. Lebensfähige Zellen wurden mit FACS Aria II durch Gating von DAPI-negativen CD45-positiven Zellen sortiert und anschließend mit der Software FlowJo v10.8.1 analysiert, wie in der ergänzenden Abbildung 5b gezeigt.

Die scRNA-Seq- und scTCR-Seq-Bibliotheken wurden mit den 10x Chromium Single-Cell 5'-Reagenzienkits v2 (Dual Index) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt. Kurz gesagt, nach der Zellsortierung wurden Einzelzellsuspensionen in den Chromium-Controller geladen, um Tröpfchen im Nanolitermaßstab mit eindeutig mit einem Barcode versehenen 5′-Gelkügelchen, sogenannten GEMs (Gel Bead-in Emulsions), herzustellen. Nach der GEM-RT wurden die GEMs mit Dyna-Beads MyOne Silane-Beads (Thermo Fisher Scientific, 37002D) gereinigt. Gemäß den Anweisungen des Herstellers wurde die cDNA mit SPRI-Beads (Beckman Coulter, B23317) amplifiziert und größenselektiert. Schließlich wurden die 5'-Transkript- und TCR-seq-Bibliotheken gepoolt und mit dem Illumina NovaSeq 6000-System sequenziert.

FASTQ-Dateien wurden mit der Software Cell Ranger v.6.1.2 (10x Genomics) unter Verwendung des GRCm38-Genoms (GENCODE vM23/Ensembl 98) als Referenz verarbeitet. Die in R mit dem Seurat v.4.1.0-Paket analysierten Daten wurden mithilfe einer ankerbasierten Einzelzellen-Datenintegrationsmethode in Seurat84 zusammengeführt und integriert. Zellen mit einem mitochondrialen RNA-Gehalt von mehr als 5 % wurden ausgeschlossen. Gene mit variablen Merkmalen wurden auf 2000 Gene festgelegt. Nach der Integration der Datensätze wurden die Daten in eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) basierend auf variablen Genen eingegeben. Dieselben Hauptkomponenten wurden zur Generierung der Uniform Manifold Approximation and Projections (UMAPs) verwendet. Cluster wurden mithilfe von Shared Nearest Neighbor-based (SNN-basiertem) Clustering identifiziert. Für die Clusteranalyse wurden die Funktionen RunUMAP, FindClusters und FindNeighbors in Seurat verwendet. Die Einzelzell-TCR-Sequenzierung wurde mit der Software cellranger-vdj (v.6.1.2) abgeglichen und quantifiziert. Für die Datenanalyse wurde die Ausgabedatei filtered_contig_annotations.csv verwendet.

Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden von 8 gesunden Spendern unter Verwendung des Ficoll Paque Plus-Gradienten (Merck Millipore, MA, Kat.-Nr. GE17-1440-02) gewonnen. PBMCs wurden in Duplikaten zu 96 Wellplatten mit U-Boden (0,5 × 106 Zellen/Well) gegeben und mit 7DW8-5 bei einer Endkonzentration von 0,1 und 1 mM stimuliert. Parallel dazu wurden PBMCs auch mit 18:1 PE bei einer Endkonzentration von 1 mM behandelt. PBMCs wurden 24 Stunden lang bei 37 °C in einer 5 % CO2-Atmosphäre stimuliert. In den letzten 4 Stunden wurde Brefeldin A in einer Menge von 10 mg/ml zugegeben und für weitere 4 Stunden inkubiert. Danach wurden die PBMC-Überstände geerntet und zur Analyse des sezernierten IFN-γ durch Luminex (Invitrogen, Waltham, MA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gelagert. PBMCs wurden gewaschen und mit PE-Cy7 Anti-CD3 (Klon: SK7), PERCP Cy5.5 Anti-TCRVα24 (Klon: C15), AF647 Anti-CD161 (Klon: HP3G10), AF700 Anti-CD8 (Klon: RPA-) gefärbt. T8) und APC-Cy7 Anti-CD69 (Klon: FN50) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Färbung wurden die Zellen permeabilisiert und 40 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Anti-Human-IFN-γ-Antikörper gefärbt. Nach der Färbung wurden die Zellen zweimal mit Waschlösung gewaschen und zur sofortigen durchflusszytometrischen Erfassung in PBS resuspendiert. Für die FACS-Erfassung wurden 1 × 105 Lymphozyten mit einem BD LSR Fortessa (BD Biosciences, San Jose, CA) Durchflusszytometer erfasst. Die Datenerfassung erfolgte mit der FACS DIVA-Software (BD Biosciences, San Jose, CA) und die Datenanalyse mit der FlowJo-Software (Version 10.6.2, BD Biosciences, San Jose, CA).

Wie wir zuvor berichteten, wurden menschliche iNKT-Zelllinien und HeLa-Zellen etabliert, die mit dem menschlichen CD1d-Gen HeLa-hCD1d transfiziert waren. Zwanzigtausend menschliche iNKT-Zelllinien von drei verschiedenen Spendern wurden mit 2 × 104 HeLa-hCD1d in einer Vertiefung einer 96-Well-Rundbodenplatte in Gegenwart von 1 µg/ml 7DW8-5-Glykolipid, 18:1 PE, co-kultiviert oder Kochsalzlösung (Kontrollen). Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Kulturüberstände gesammelt und mittels ELISA auf das Vorhandensein von IFN-γ untersucht.

Von stimulierten menschlichen iNKT-Zelllinien gesammelte Überstände wurden seriell verdünnt (2-fach) und auf einer Monoschicht von Huh7-Zellen über Nacht bei 37 °C/5 % CO2 20 Stunden lang inkubiert. Als Positivkontrolle wurde eine fünffache Serienverdünnung des rekombinanten menschlichen IFN-γ-Proteins verwendet (Gibco Kat.-Nr. PHC4031). Darüber hinaus wurden die Überstände mit Anti-Human-IFN-γ-Antikörper (1 µg/ml) (BioXcell Cat# BE0235) kombiniert und gemischt, um auf spezifische und unspezifische Wirkungen zu prüfen. Im Anschluss an diese Inkubation wurden die Zellen mit ic-SARS-CoV-2-mNeon-Isolat64 infiziert und unter ähnlichen Bedingungen weitere 24 Stunden lang inkubiert. Nach 24 Stunden wurden die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um GFP+-Zellen zu zählen, und die prozentuale Hemmung wurde als Fluoreszenzunterschied in den Testvertiefungen im Vergleich zu Vertiefungen, die keine Behandlung erhielten (nur Virus), berechnet und mit GraphPad Prism v9.3 aufgezeichnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie verwendeten Materialien werden zur Verfügung gestellt, erfordern jedoch möglicherweise den Abschluss einer Vereinbarung zur Materialübertragung. Alle Daten sind im Papier oder in den Zusatzinformationen enthalten. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. mRNA-Sequenzierungsdaten zum Vergleich der differentiellen Genexpression und RNA-Sequenzierungsdaten im Zusammenhang mit Einzelzell-RNA-Seq-Experimenten wurden auf dem Server des Europäischen Bioinformatik-Instituts (EBI) über die ArrayExpress-Datenbank unter Verwendung der Zugangscodes E-MTAB-12345 für mRNA und E zur Verfügung gestellt -MTAB-11770 für die Einzelzellsequenzierung. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Studie wurde durch Mittel der JPB Foundation, Andrew und Peggy Cherng, Samuel Yin, Carol Ludwig, David und Roger Wu an DDH unterstützt. Experimente mit K18-hACE2-transgenen Mäusen und Hamstern wurden an der Washington University mit Unterstützung von NIH durchgeführt: R01 AI157155 (für MSD), 75N93019C00051 (für MSD), 75N93021C00016 (für ACMB) und U01 AI151810 (für MSD und ACMB).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Candace Castagna.

Aaron Diamond AIDS Research Center, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Yukiko Tsuji, Yaoxing Huang und David D. Ho

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Moriya Tsuji, Manoj S. Nair, Kazuya Masuda, Yaoxing Huang und David D. Ho

Institut für Vergleichende Medizin, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Candace Castagna & Laura Corredor

Medizinische Fakultät, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Zhenlu Chong, Tamarand L. Darling, Kuljeet Seehra, Adrianus CM Boon und Michael S. Diamond

Columbia Center for Human Development, Pulmonary Allergy & Critical Care Medicine, Abteilung für Medizin, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, 10032, USA

Youngmin Hwang und Munemasa Mori

Labor für grundlegende und angewandte Virologie, Abteilung für Mikrobiologie, Bundesuniversität Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasilien

Ágata Lopes Ribeiro, Geovane Marques Ferreira und Jordana Grazziela Alves Coelho-dos-Reis

Abteilung für Molekulare Mikrobiologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Adrianus CM Boon & Michael S. Diamond

Abteilung für Pathologie und Immunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Adrianus CM Boon & Michael S. Diamond

Das Andrew M. und Jane M. Bursky Center for Human Immunology and Immunotherapy Programs, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Michael S. Diamond

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Columbia University Vagelos College of Physicians and Surgeons, New York, NY, 10032, USA

David D. Ho

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MT, MSN, YT, YH und DDH haben das Projekt konzipiert. MT, CC, LC und ZC führten die Mausexperimente durch. TLD und KS führten die Hamsterexperimente durch. MSN, ZC, TLD, KS und YH führten die Virustitrationsexperimente durch. KM führte die Einzelzellanalysen mit 10X Genomics durch. YH und MM führten die histologische Analyse durch. ALR und GMF trugen zum durchflusszytometrischen Assay bei. MT, MSN, KM, JGAC-d.-R, YT, ACMB, MSD und DDH analysierten die Ergebnisse. MT und DDH haben das Manuskript mit Beiträgen jedes Autors verfasst.

Korrespondenz mit Moriya Tsuji, Yaoxing Huang oder David D. Ho.

MT, MSN, YH und DDH sind als Miterfinder in einem vorläufigen Patentantrag der Columbia University für die in diesem Manuskript beschriebene Behandlung von COVID-19 und anderen viralen Atemwegsinfektionen mit 7DW8-5 aufgeführt. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt David Markovitz, dem anderen anonymen Gutachter, für seinen Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tsuji, M., Nair, MS, Masuda, K. et al. Ein immunstimulierendes Glykolipid, das SARS-CoV-2-, RSV- und Influenza-Infektionen in vivo blockiert. Nat Commun 14, 3959 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39738-1

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 27. Juni 2023

Veröffentlicht: 05. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39738-1

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Nature Reviews Mikrobiologie (2023)

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