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Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 4895 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der opportunistische Pilzerreger Cryptococcus neoformans verursacht bei immungeschwächten Patienten tödliche Infektionen. Makrophagen spielen eine zentrale Rolle bei der Reaktion des Wirts auf Kryptokokken. Es ist jedoch unklar, wie C. neoformans von Makrophagen erkannt und phagozytiert wird. Hier untersuchen wir die Rolle von TLR4 bei der nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans. Wir stellen fest, dass der Verlust der TLR4-Funktion die Phagozytose nicht opsonisierter Kryptokokken durch murine und menschliche Makrophagen unerwartet erhöht. Die in Tlr4−/−-Zellen beobachtete erhöhte Phagozytose wurde durch die Vorbehandlung von Makrophagen mit oxidiertem LDL, einem bekannten Liganden von Scavenger-Rezeptoren, gedämpft. Der Scavenger-Rezeptor, Makrophagen-Scavenger-Rezeptor 1 (MSR1) (auch bekannt als SR-A1 oder CD204), war in Tlr4-/-Makrophagen hochreguliert. Die genetische Ablation von MSR1 führte zu einem Rückgang der Phagozytose nichtopsonisierter Kryptokokken um 75 %, was stark darauf hindeutet, dass es sich um einen wichtigen nichtopsonischen Rezeptor für diesen Erreger handelt. Wir zeigen weiterhin, dass die MSR1-vermittelte Aufnahme wahrscheinlich die Bildung eines multimolekularen Signalkomplexes mit FcγR beinhaltet, der zur Aktivierung von SYK, PI3K, p38 und ERK1/2 führt, um den Aktin-Remodelling und die Phagozytose voranzutreiben. Insgesamt deuten unsere Daten auf eine bisher nicht identifizierte Rolle des TLR4/MSR1-Crosstalks bei der nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans hin.

Cryptococcus neoformans ist ein eingekapselter Hefepilz, der bei Menschen und anderen Tieren lebensbedrohliche Infektionen verursacht1,2, mit einer geschätzten weltweiten Belastung von 181.000 Todesfällen pro Jahr3. Eine Infektion mit C. neoformans beginnt mit der Inhalation von Pilzzellen aus der Umgebung in die Lunge1. In der Lunge gehören geweberesidente Makrophagen zu den ersten Immunzellen, denen die Pilze begegnen.4 Daher wird angenommen, dass die Interaktion zwischen Wirtsmakrophagen und eindringenden Pilzen ein wichtiger Faktor für das Fortschreiten und den Ausgang der Krankheit ist. Nicht opsonisierte Kryptokokken werden schlecht phagozytiert5, aber da opsonisierende Antikörper in der gesunden Lunge vernachlässigbar sind6, ist dieser geringe Grad der nichtopsonischen Aufnahme wahrscheinlich ein entscheidender Faktor für den weiteren Verlauf einer Infektion. Es gibt jedoch kein klares Verständnis des Mechanismus, durch den Makrophagen C. neoformans in Abwesenheit von Opsoninen erkennen und phagozytieren4,7.

Phagozytose, definiert als die Aufnahme von Partikeln mit einer Größe von mehr als 0,5 μm, ist ein wichtiger Prozess der angeborenen Immunantwort, da sie zum Abbau eindringender Krankheitserreger und zur Präsentation mikrobieller Liganden auf MHC-Molekülen führt und dadurch den adaptiven Arm des Immunsystems aktiviert8 . Die nicht-opsonische Phagozytose wird durch die Erkennung pathogenassoziierter molekularer Muster (PAMPs) auf der Oberfläche von Mikroben durch Wirtsmustererkennungsrezeptoren (PRRs)8 eingeleitet. Zu den PRRs auf professionellen Phagozyten gehören Mitglieder der Familie der Toll-like-Rezeptoren (TLR), der Familie der C-Typ-Lectin-Rezeptoren (CLR) und der Familie der Scavenger-Rezeptoren (SR). All dies war in unterschiedlichem Maße an der Erkennung von C. neoformans beteiligt, wobei β-1,3-Glucane, Mannane und Glucuronoxylomannan (GXM) auf der Zellwand und Kapsel von C. neoformans als PAMPs dienen9,10,11, 12,13,14,15. Das CLR, Dectin-1 (auch bekannt als CLEC7A), ist für seine Rolle bei der Erkennung von pilzlichen β-Glucanen11 bekannt und wurde als Schlüssel-PRR bei der Phagozytose von Candida albicans16,17 identifiziert. Frühere Arbeiten ergaben jedoch, dass Dectin-1 nur geringfügig an der Phagozytose von nicht-opsonisierten C. neoformans5 beteiligt ist, was darauf hindeutet, dass andere nicht-opsonische Rezeptoren für C. neoformans möglicherweise wichtiger sind.

Innerhalb der TLR-Familie erkennt TLR4 bekanntermaßen Pilzmannane12 und GXM9, was zur Aktivierung nachgeschalteter Signalkaskaden führt. Die TLR4-Signalisierung wird durch die Adapterproteine ​​„Myeloid Differentiation Primary Response“ 88 (MyD88) und „TIR-Domäne enthaltendes Adapter-induzierendes Interferon-β“ (TRIF)18 vermittelt. Der MyD88-abhängige Signalweg wird von allen TLRs verwendet, mit Ausnahme von TLR3, das stattdessen TRIF-abhängige Signalisierung verwendet19,20. Der MyD88-abhängige Weg und der TRIF-abhängige Weg führen letztendlich zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors Kernfaktor κB (NF-κB) und mitogenaktivierter Proteinkinasen (MAPKs)20. Der TRIF-Weg führt auch zur Aktivierung des Interferon-Regulierungsfaktors 3 (IRF3). Diese aktivieren dann die Expression und Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen (MyD88- und TRIF-Weg) und Typ-I-Interferonen (TRIF-Weg)8,18,21. Bemerkenswerterweise aktivieren Plasmamembran-TLRs auch Rap-GTPase und Rac-GTPase, um phagozytische Integrine und andere echte phagozytische Rezeptoren zu aktivieren, die dann für die Aufnahme von Krankheitserregern verantwortlich sind22.

Während wir die Rolle des TLR-Signals bei der Entzündungsreaktion auf Kryptokokken untersuchten, machten wir die unerwartete Entdeckung, dass der Verlust der TLR4-Aktivität zu einer verstärkten nicht-opsonischen Aufnahme des Pilzes führt. Wir zeigen, dass dieser Anstieg der Aufnahme durch Übersprechen zwischen TLR4 und Macrophage Scavenger Receptor 1 (MSR1) (auch bekannt als SR-A1 oder CD204) verursacht wurde, sodass der Verlust der TLR4-Signalisierung zu einer erhöhten Zelloberflächenexpression von MSR1 führte, dies jedoch nicht der Fall war andere SRs, was zu einer erhöhten Aufnahme führt. Wir liefern Beweise dafür, dass MSR1 ein wichtiger Rezeptor für die nicht-opsonische Phagozytose von C. neoformans ist, und geben Aufschluss über einen wichtigen Wirtsrezeptor, der an der Aufnahme dieses Pilzpathogens beteiligt ist.

Um die Rolle von TLR4 bei der Phagozytose von nicht opsonisierten C. neoformans zu untersuchen, wurden J774A.1-Mausmakrophagen eine Stunde lang mit 0,2 μM TAK-242, einem Inhibitor der TLR4-Signalübertragung, behandelt, bevor sie mit C. neoformans infiziert wurden, die sich noch in ihnen befanden Anwesenheit des Inhibitors. Überraschenderweise führte die TLR4-Hemmung zu einem 1,7-fachen Anstieg der Phagozytose nichtopsonisierter Kryptokokken (Abb. 1a). Wir haben getestet, ob der genetische Verlust von TLR4 diesen Effekt reproduzieren würde, indem wir immortalisierte Knochenmarksmakrophagen (iBMDMs) verwendet haben, die aus Wildtyp- und Tlr4−/− C57BL/6-Mäusen isoliert wurden. Wie bei der chemischen Hemmung von TLR4 führte der genetische Knockout von TLR4 zu einem deutlichen 8-fachen Anstieg der Phagozytose von nicht opsonisierten C. neoformans (Abb. 1b, d). Um die Relevanz dieses Befundes für den Menschen zu untersuchen, wurde menschlichen Monozyten-Makrophagen (HMDMs) zwei Stunden lang Serum entzogen, sie wurden mit 0,2 μM TAK242 vorbehandelt und mit C. neoformans infiziert. Ähnlich wie bei Mäusezelllinien führte der Verlust des TLR4-Signals zu einem Anstieg der nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans (Abb. 1c).

a J774A.1-Makrophagen oder (c) von menschlichen Monozyten abgeleitete Makrophagen (HMDMs) wurden vor der Infektion mit nicht opsonisierten C. neoformans eine Stunde lang mit DMSO (Kontrolle) oder 0,2 μM TAK-242, einem TLR4-spezifischen Inhibitor, behandelt. b Immortalisierte, aus dem Knochenmark stammende Makrophagen (iBMDM) vom Wildtyp und Tlr4-/-Makrophagen wurden mit nicht opsonisierten C. neoformans infiziert. Die Phagozytose wurde als Anzahl einzelner internalisierter Kryptokokken innerhalb von 100 Makrophagen quantifiziert. Die Zahlen sind repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente. HMDM-Daten stellen zwei unabhängige Experimente mit getrennten Spendern dar. d Repräsentatives Bild, das die Phagozytose von GFP-markiertem C. neoformans (Cn-GFP) durch Wildtyp und Tlr4−/− iBMDM zeigt. Calcofluor White (CFW) wurde zur Färbung extrazellulärer Pilze verwendet. Weiße Pfeile zeigen phagozytierte Pilze. Maßstabsbalken = 10 μm. Die intrazelluläre Proliferation (IPR) von C. neoformans wurde in (e) J774A.1-Makrophagen und (f) Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs mittels Zeitrafferbildgebung gemessen. Die Bilder wurden 18 Stunden lang alle 5 Minuten aufgenommen. Die Anzahl der internalisierten Pilze pro 100 Makrophagen im „ersten Frame“ (T0) und „letzten Frame“ (T10) wurde quantifiziert und der IPR wurde mithilfe der Gleichung bestimmt: IPR = T10/T0. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt; n = 3 pro Bedingung; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen T-Tests bewertet. P-Werte werden über jedem Diagramm angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wurde gezeigt, dass proinflammatorische Reaktionen, wie sie beispielsweise durch TLR4 hervorgerufen werden, die intrazelluläre Proliferation von Kryptokokken einschränken23. Daher gingen wir davon aus, dass der wahrgenommene Anstieg der Phagozytose stattdessen eine erhöhte Proliferation ohne TLR4-Aktivität widerspiegeln könnte. Um diese Hypothese zu testen, führten wir eine Live-Bildgebung infizierter Makrophagen durch und quantifizierten die Anzahl der internalisierten Pilze zu Beginn des Videos (T0) und 10 Stunden nach der Infektion (T10), um die intrazelluläre Proliferationsrate (IPR) zu bestimmen. Dieser zeitrafferbasierte IPR-Assay ergab, dass weder die TLR4-Hemmung mit TAK-242 (Abb. 1e) noch der TLR4-Knockout (Abb. 1f) den IPR von Kryptokokken im Vergleich zu Kontrollmakrophagen veränderte. Dies legt nahe, dass die beobachtete intrazelluläre Belastung durch C. neoformans repräsentativ für die anfängliche Aufnahmerate ist und nicht auf Unterschiede in der anschließenden Proliferation der Pilze innerhalb von Makrophagen zurückzuführen ist.

Nachdem wir gezeigt hatten, dass die erhöhte intrazelluläre Infektionslast nach TLR4-Hemmung oder -Knockout auf eine erhöhte Phagozytose und nicht auf Proliferation zurückzuführen ist, versuchten wir als nächstes, den Plasmamembranrezeptor zu identifizieren, der für diese erhöhte Aufnahme verantwortlich ist. Bemerkenswert ist, dass Plasmamembran-TLRs keine echten phagozytischen Rezeptoren sind, da sie nicht direkt für die Aufnahme ganzer Mikroorganismen verantwortlich sind22. Folglich haben wir überlegt, ob TLR4 die Verfügbarkeit eines oder mehrerer phagozytischer Rezeptoren moduliert, die dann nicht-opsonisierte C. neoformans binden.

Scavenger-Rezeptoren, eine Familie von Rezeptoren, die ursprünglich für ihre Rolle bei der Aufnahme modifizierter Wirts-Lipoproteine24 identifiziert wurden, werden zunehmend als Rezeptoren für eine Vielzahl von Mikroben und deren Liganden in Betracht gezogen25,26,27. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Expression mehrerer Scavenger-Rezeptoren in Tlr4-/−-Mäusen hochreguliert ist28 und dass TLR-Agonisten die Phagozytose von Escherichia coli erhöhen, indem sie die Expression von Scavenger-Rezeptoren induzieren29. Wir haben daher getestet, ob der Verlust der TLR4-Signalübertragung die Phagozytose von nicht opsonisierten C. neoformans durch die Hochregulierung von Scavenger-Rezeptoren erhöht.

Zunächst behandelten wir Makrophagen vor der Infektion mit C. neoformans mit oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (ox-LDL), einem allgemeinen Scavenger-Rezeptorliganden und kompetitiven Inhibitor. Wir fanden heraus, dass Ochsen-LDL die Phagozytose von C. neoformans sowohl in Wildtyp- als auch in Tlr4-/−-Makrophagen kompetitiv hemmen konnte (Abb. 2a, b). Wenn Makrophagen stattdessen mit 18B7-Antikörper-opsonisierten Pilzen infiziert wurden, um die Aufnahme über Fcγ-Rezeptoren voranzutreiben, hatte die Vorbehandlung mit Ochsen-LDL keinen Einfluss auf die Phagozytose von Kryptokokken sowohl bei Wildtyp- als auch bei Tlr4-/−-Makrophagen (Abb. 2c), was darauf hindeutet Die Hemmung ist spezifisch für die nichtopsonische Aufnahme. Ähnlich wie bei einer murinen Zelllinie zeigten mit Ochsen-LDL vorbehandelte HMDMs auch eine verringerte Phagozytose von nicht-opsonischen C. neoformans (Abb. 2d), wenn auch nicht so signifikant wie in Mauszellen, was darauf hindeutet, dass Scavenger-Rezeptoren allgemein relevante Rezeptoren sind an der Aufnahme von C. neoformans beteiligt.

a Wildtyp-iBMDMs (n = 6 pro Zustand), b Tlr4−/− iBMDMs (n = 6 pro Zustand) und d von menschlichen Monozyten abgeleitete Makrophagen (HMDMs) (n = 3 pro Zustand) wurden mit oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte behandelt ( ox-LDL), einem allgemeinen Scavenger-Rezeptorliganden, für 30 Minuten vor der Infektion mit nicht opsonisierten C. neoformans. iBMDM-Daten werden aus zwei unabhängigen Experimenten gepoolt. HMDM-Daten stellen zwei unabhängige Experimente mit getrennten Spendern dar. c Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs (n = 3 pro Zustand) wurden 30 Minuten lang mit 10 μg/ml ox-LDL behandelt und dann mit C. neoformans infiziert, der mit dem antikapsulären 18B7-Antikörper opsoniert war. Die Anzahl internalisierter Pilze pro 100 Makrophagen wurde anhand von Fluoreszenzmikroskopbildern quantifiziert. Die Daten repräsentieren zwei unabhängige Experimente. Alle Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe eines ungepaarten zweiseitigen T-Tests (a, b, d) bewertet. oder Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test (c). P-Werte werden über jedem Diagramm angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Oxidiertes LDL ist ein Rezeptor für eine Vielzahl von Scavenger-Rezeptoren; Um daher herauszufinden, welche spezifischen Scavenger-Rezeptoren für die Phagozytose von C. neoformans verantwortlich sein könnten, haben wir die Oberflächenexpression der Scavenger-Rezeptoren CD36, MAcrophage Receptor with COllagenous Structure (MARCO) und Macrophage Scavenger Receptor 1 (MSR1) analysiert. , auch bekannt als SR-A1 oder CD204, mittels Durchflusszytometrie. Wildtyp- und Tlr4-/−-Makrophagen exprimieren hohe Mengen an CD36 (Abb. 3a; ergänzende Abb. 1a); Da der CD36-Spiegel jedoch zwischen Wildtyp- und Tlr4-/-Makrophagen ähnlich ist, kann er nicht für den unterschiedlichen Grad der nicht-opsonischen Aufnahme zwischen diesen beiden Zelltypen verantwortlich sein. Beide Zelltypen exprimierten sehr wenig MARCO (Abb. 3b; ergänzende Abb. 1b, x-Achse), im Einklang mit Studien, die zeigen, dass iBMDMs kein MARCO30 exprimieren. Bemerkenswert ist jedoch, dass die MSR1-Expression in Tlr4-/−-Makrophagen im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen höher war (Abb. 3c; ergänzende Abb. 1b, y-Achse), was darauf hindeutet, dass die in Tlr4-/−-Makrophagen beobachtete erhöhte Phagozytose von C. neoformans möglicherweise auftritt Dies kann auf die erhöhte Expression von MSR1 zurückzuführen sein.

Basisoberflächenexpression eines mit Anti-Maus-CD36-BB515-Antikörper gefärbten CD36; b Makrophagenrezeptor mit kollagener Struktur (MARCO), gefärbt mit Anti-Maus-MARCO-Fluorescein-Antikörper; und c Macrophage Scavenger Receptor 1 (MSR1), auch bekannt als CD204, gefärbt mit Anti-Maus-CD204-PE-Antikörper auf Wildtyp- und Tlr4-/−-Makrophagen. Die Rezeptorexpression wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen. Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente, die ähnliche Ergebnisse lieferten. Die Zahlen über den Gates beziehen sich auf den Prozentsatz der CD36-, MARCO- und MSR1-positiven Zellen. d MPI-Zellen, eine nicht transformierte GM-CSF-abhängige Maus-Makrophagen-Zelllinie, isoliert aus Wildtyp-, Msr1-/--, Marco-/-- und MSR1/MARCO-Double-Knockout-Mäusen (DKO), wurden mit nicht-opsonisierten C. infiziert. Neoformans. Die gezeigten Daten stammen aus drei unabhängigen Experimenten (n = 9). Die Daten sind Mittelwerte ± SEM; Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA bewertet. P-Werte werden über dem Diagramm angezeigt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die direkte Beteiligung einzelner Scavenger-Rezeptoren an der Phagozytose von Kryptokokken zu testen, infizierten wir anschließend MPI-Zellen (eine nicht transformierte GM-CSF-abhängige Maus-Makrophagenzelllinie30), die vom Wildtyp, Msr1−/−, Marco−/− oder MSR1 abgeleitet waren /MARCO Double Knockout (DKO) C57BL/6-Mäuse mit nicht opsonisierten C. neoformans. Während die Aufnahme durch Marco-/−-Makrophagen nicht von Wildtyp-Zellen zu unterscheiden war, zeigten von Msr1-/−-Mäusen stammende Makrophagen einen signifikanten Rückgang der Phagozytose nicht opsonisierter Kryptokokken um 75 % (Abb. 3d). Double-Knockout-Makrophagen zeigten eine ähnliche Verringerung der Aufnahme wie Single-Knockout-Msr1-/-Makrophagen, was darauf hindeutet, dass der Phänotyp in Double-Knockout-Zellen wahrscheinlich auf den Verlust von MSR1 und nicht auf MARCO zurückzuführen ist. Bemerkenswerterweise beobachten wir immer noch eine gewisse nicht-opsonische Aufnahme in MSR1- und Double-Knockout-Makrophagen, was darauf hindeutet, dass ein oder mehrere zusätzliche PRRs eine Rolle bei der nicht-opsonischen Aufnahme von Kryptokokken spielen.

Um zu testen, ob der zuvor beobachtete TLR4-MSR1-Crosstalk auch in diesen MPI-Zellen auftrat, setzten wir Wildtyp-MPI-Zellen dem TLR4-Inhibitor TAK-242 aus. In Übereinstimmung mit unseren früheren Erkenntnissen führte die TR4-Hemmung zu einem Anstieg der Phagozytose nicht opsonisierter Kryptokokken (ergänzende Abbildung 2). Darüber hinaus beobachteten wir mithilfe der konfokalen Mikroskopie zur Visualisierung der Verteilung von MSR1 auf infizierten Tlr4-/−-Makrophagen eine gewisse Ansammlung von MSR1 um Phagozytenbecher mit Kryptokokken (ergänzende Abbildung 3).

Nachdem wir das Vorhandensein eines Crosstalks zwischen TLR4 und MSR1 bei der nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans identifiziert hatten, versuchten wir anschließend, den Mechanismus der MSR1-vermittelten Phagozytose sowie den Mechanismus der TLR4-vermittelten Regulierung der MSR1-Aktivität zu untersuchen. Den Scavenger-Rezeptoren fehlt eine klare intrazelluläre Signaldomäne. Es wird daher angenommen, dass die durch Scavenger-Rezeptoren vermittelte Internalisierung und proinflammatorische Zytokinproduktion Korezeptoren und Adaptermoleküle erfordert, die zur Bildung multimolekularer Signalkomplexe führen26. Da die erhöhte Aufnahme von C. neoformans in Tlr4–/–-Makrophagen wahrscheinlich auf die erhöhte Expression von MSR1 in diesen Zellen zurückzuführen ist, verwendeten wir Tlr4–/–-Makrophagen als Instrument zur Identifizierung potenzieller Proteine, die an der MSR1-vermittelten Phagozytose beteiligt sind.

Es gibt Hinweise darauf, dass TLR-TLR-Crosstalk die Zytokinexpression moduliert31. Daher haben wir uns gefragt, ob TLR-TLR-Crosstalk möglicherweise auch die Phagozytose von Kryptokokken beeinflusst. Frühere Arbeiten haben vier verschiedene TLRs im Zusammenhang mit einer C. neoformans-Infektion untersucht: TLR2, TLR3, TLR4 und TLR932,33,34. Um das Vorhandensein von TLR-TLR-Crosstalk zu untersuchen, behandelten wir daher Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs vor der Infektion mit C. mit Inhibitoren von TLR2 (CU CPT22), TLR3 (TLR3/dsRNA-Komplex-Inhibitor) und TLR9 (ODN 2088). Neoformans. Obwohl die Hemmung von TLR2 und TLR9 keinen Einfluss auf die nicht-opsonische Aufnahme von C. neoformans hatte, führte die Hemmung von TLR3 zu einer Verringerung der Aufnahme durch Wildtyp-iBMDMs (Abb. 4a). Die bei Tlr4-/−-Makrophagen beobachtete verstärkte Phagozytose wurde durch die TLR3-Hemmung gedämpft, was zu einem Rückgang der Anzahl phagozytierter Pilze um 42 % führte, jedoch nicht nach TLR2- oder TLR9-Hemmung (Abb. 4b). Interessanterweise führte ein TLR4-Mangel immer noch zu einem Anstieg der Aufnahme, als Makrophagen mit C. neoformans infiziert wurden, der mit dem antikapsulären 18B7-Antikörper opsoniert war, aber die Wirkung der TLR3-Hemmung ging sowohl in Wildtyp- als auch in Tlr4-/--Zellen verloren (Abb. 4c). Daher ist die Rolle von TLR3 bei der Modulation der Phagozytose von C. neoformans spezifisch für die nicht-opsonische Aufnahme.

a Wildtyp- und b Tlr4-/−-iBMDMs wurden 1 Stunde lang mit chemischen Inhibitoren von TLR2, TLR3 und TLR9 behandelt und dann mit nicht opsonisierten C. neoformans infiziert. Die Daten werden aus drei unabhängigen Experimenten zusammengefasst (n = 9 pro Bedingung). c Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs wurden mit einem TLR3-Inhibitor behandelt und dann mit C. neoformans infiziert, der mit dem antikapsulären 18B7-Antikörper opsoniert war (n = 3 pro Zustand). d, e Tlr4−/−-Makrophagen wurden einzeln und in Kombination mit optimalen und suboptimalen Konzentrationen an TLR3-Inhibitor und Ochsen-LDL vorbehandelt (n = 3 pro Zustand). Die Phagozytose wurde als Anzahl der internalisierten Kryptokokken innerhalb von 100 Makrophagen quantifiziert. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente und werden als Mittelwert ± SEM angezeigt; Die statistische Signifikanz wurde mittels (a, b, d, e) einfaktorieller ANOVA oder (c) zweifaktorieller ANOVA, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test, bewertet. P-Werte werden über jedem Diagramm angezeigt. f Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs wurden 1 Stunde lang mit 0,025 % DMSO (Kontrolle) oder 10 μM TLR3-Inhibitor behandelt. Die Expression von MSR1 (auch bekannt als CD204) wurde unter Verwendung des monoklonalen Anti-Maus-CD204-PE-Antikörpers gemessen. Als Isotypkontrolle wurde PE-markiertes Ratten-IgG2a κ verwendet. Die Proben wurden durch ein Durchflusszytometer geleitet und in der FlowJo-Software analysiert. Prozentangaben beziehen sich auf den Prozentsatz der MSR1-positiven Zellen. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den Zusammenhang zwischen TLR3 und Scavenger-Rezeptoren zu untersuchen, wurden Tlr4-/−-iBMDMs einzeln und in Kombination mit TLR3i und ox-LDL vorbehandelt. Wir behandelten Makrophagen zunächst mit den wirksamen Konzentrationen von TLR3i (10 μM) und Ochsen-LDL (10 μg/ml) und stellten fest, dass die Kombinationsbehandlung die Phagozytose nicht stärker dämpfte als die Einzelbehandlungen (Abb. 4d). Dies deutet darauf hin, dass entweder TLR3- und Scavenger-Rezeptoren auf demselben Weg wirken oder dass diese Konzentrationen der jeweiligen Inhibitoren gesättigt sind, was zu keiner weiteren Unterdrückung führt, wenn beide Inhibitoren verwendet werden.

Als nächstes haben wir, inspiriert von einer Studie, die zeigte, dass Msr1+/- oder Tlr4+/- einzelne heterozygote Mäuse keine Beeinträchtigung der Phagozytose von E. coli zeigten, doppelte Heterozygoten jedoch fehlerhafte Phagozytose aufwiesen35, dann getestet, ob unter Verwendung einer niedrigeren Konzentration von Ochsen-LDL und TLR3i einzeln und in Kombination würden zu Synergien führen. Wenn Tlr4-/-Makrophagen mit 1 μM TLR3i oder 1 μg/ml ox-LDL behandelt wurden, gab es keinen Unterschied in der Phagozytose von C. neoformans im Vergleich zu unbehandelten Zellen (Abb. 4e). Bei gleichzeitiger Behandlung mit 1 μM TLR3i und 1 μg/ml ox-LDL kam es jedoch zu einem Rückgang der Phagozytose (Abb. 4e). Wir kommen zu dem Schluss, dass beide Rezeptoren synergetisch auf demselben Weg wirken, da der verbleibende „Fluss“ durch den Weg bei Verwendung einer niedrigen Inhibitordosis durch die Behandlung mit beiden Inhibitoren weiter gedämpft wurde.

Eine mögliche Interpretation der oben präsentierten Daten wäre ein Modell, bei dem der Verlust der TLR4-Signalübertragung eine erhöhte TLR3-Signalübertragung auslöst, was zu einer Hochregulierung der Scavenger-Rezeptoren führt. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die MSR1-Expression in Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs nach 1-stündiger TLR3-Hemmung gemessen. Wir fanden jedoch keine signifikanten Veränderungen in der MSR1-Expression, nachdem sowohl Wildtyp- als auch Tlr4-/−-Makrophagen mit dem TLR3-Inhibitor behandelt wurden (Abb. 4f), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkung zwischen MSR1 und TLR3 nicht auf der Ebene einer direkten TLR3-vermittelten Regulation liegt des MSR1-Ausdrucks.

Die TLR4- und TLR3-Signalisierung erfordert die Downstream-Adaptermoleküle MyD88 (von TLR4 verwendet) und TRIF (sowohl von TLR4 als auch von TLR3 verwendet)20. Um die beteiligten Downstream-Signalwege zu verstehen, wurden Makrophagen daher Inhibitoren von MyD88, TRIF, IKKβ (einer Kinase stromabwärts von MyD88, die für die NF-κB-Aktivierung36 erforderlich ist) und TBK1 (einer Kinase stromabwärts von TRIF, die phosphoryliert) ausgesetzt und aktiviert IRF337). Bei Wildtyp-iBMDMs führte die Behandlung mit allen vier Inhibitoren zu einer verminderten nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans (Abb. 5a). Ebenso dämpften alle vier Inhibitoren die bei TLR4-defizienten Makrophagen beobachtete erhöhte Phagozytose (Abb. 5b). In Übereinstimmung mit den Erkenntnissen aus den Inhibitorbehandlungen waren Makrophagen aus Myd88-/-- und Trif-/--Mäusen bei der Phagozytose von C. neoformans beeinträchtigt, wobei in diesen Zellen nur wenige oder keine Phagozytoseereignisse beobachtet wurden (Abb. 5c).

a Wildtyp- und b Tlr4-/−-Makrophagen wurden mit Inhibitoren von MyD88, IKKβ (einer Kinase stromabwärts von MyD88, die für die Aktivierung von NF-κB notwendig ist), TRIF und TBK1 (einer Kinase stromabwärts von TRIF, die IRF3 phosphoryliert und aktiviert) behandelt. n = 6 pro Bedingung). Nach der Vorbehandlung mit den verschiedenen Inhibitoren wurden die Zellen mit nicht opsonisiertem C. neoformans infiziert. Die Daten werden aus zwei unabhängigen Experimenten zusammengefasst. c Immortalisierte BMDMs aus Wildtyp-, Tlr4−/−-, MyD88−/−- und Trif−/−-Makrophagen wurden mit nicht opsonisierten C. neoformans infiziert (n = 3). Die Daten sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Phagozytose wurde als Anzahl internalisierter Kryptokokken innerhalb von 100 Makrophagen quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM und werden mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test analysiert. P-Werte werden über jedem Diagramm angezeigt. d Die grundlegende Oberflächenexpression von Macrophage Scavenger Receptor 1 (MSR1) (auch bekannt als CD204) wurde in Wildtyp-, Tlr4-/--, MyD88-/-- und Trif-/-Makrophagen unter Verwendung des Anti-Maus-CD204-PE-Antikörpers gemessen. Als Isotypkontrolle wurde PE-markiertes Ratten-IgG2a κ verwendet. Die Rezeptorexpression wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen und mit der FlowJo-Software analysiert. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Prozentangaben beziehen sich auf den Prozentsatz der MSR1-positiven Zellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um sicherzustellen, dass der Aufnahmeverlust in MyD88- und TRIF-defizienten Makrophagen nicht durch einen inhärenten Mangel an phagozytischer Kapazität verursacht wurde, infizierten wir iBMDMs mit CAF2-dTomato Candida albicans38. Wir fanden heraus, dass MyD88-/-- und Trif-/--Makrophagen den gleichen Grad an Phagozytose aufwiesen wie Wildtyp-Makrophagen (ergänzende Abbildung 4). Somit bleiben nicht TLR-abhängige Signalwege wie der Dectin-1-Rezeptor, der als Schlüssel-PRR bei der Phagozytose von C. albicans16,17 gilt, in MyD88-/-- und Trif-/-Makrophagen intakt. Bemerkenswerterweise führte der Verlust von TLR4 jedoch auch zu einem Anstieg der Phagozytose von C. albicans (ergänzende Abbildung 4), was auf das Vorhandensein einer gemeinsamen Wirtsreaktion auf beide Pilze schließen lässt. Insgesamt ist die Phagozytose von nicht opsonisierten C. neoformans, nicht jedoch von C. albicans, von der MyD88- und TRIF-Signalisierung abhängig.

Angesichts der Tatsache, dass Myd88-/-- und Trif-/--Makrophagen einen nahezu vollständigen Verlust der Phagozytose zeigten, stellten wir die Hypothese auf, dass diese Zellen sehr wenig MSR1 exprimieren. Um dies zu testen, wurde auch die Oberflächenexpression von MSR1 auf diesen Makrophagen mittels Durchflusszytometrie gemessen. Wie bei Tlr4-/-Makrophagen zeigten Myd88-/- und Trif-/-Zellen jedoch eine erhöhte MSR1-Expression im Vergleich zu Wildtyp-iBMDMs (Abb. 5d). Darüber hinaus war der Anteil MSR1-positiver Zellen in Myd88–/–- und Trif–/–-Makrophagen ähnlich dem, der in Tlr4–/–-Makrophagen beobachtet wurde (20,4 % für Wildtyp, 71,8 % für Tlr4–/–, 65,6 % für MyD88–/– − und 74,9 % für Trif-/−-Makrophagen (ergänzende Abbildung 5)). Dies impliziert, dass eine erhöhte MSR1-Expression allein nicht ausreicht, um eine erhöhte Phagozytose voranzutreiben. Entweder MyD88 und TRIF selbst oder einige andere MyD88- und/oder TRIF-abhängige Moleküle können als Adapterproteine ​​oder Corezeptoren dienen, die für die Ansteckung mit Krankheitserregern erforderlich sind.

Um die Downstream-Signalereignisse, die während der MSR1-vermittelten Aufnahme auftreten, weiter zu untersuchen, führten wir ein kleines Inhibitor-Screening mit Tlr4-/-Makrophagen durch. Eine frühere Studie, die einen anderen Scavenger-Rezeptor, CD36, untersuchte, zeigte, dass CD36 einen Signalkomplex bildet, an dem FcγRs, Integrine und Tetraspanine beteiligt sind39. Obwohl bekannt ist, dass FcγRs die Phagozytose von Antikörper-opsonisierten C. neoformans vermitteln, haben wir, inspiriert durch diese frühere Arbeit, getestet, ob sie möglicherweise auch an der Unterstützung der nicht-opsonischen Phagozytose durch MSR1 beteiligt sind. Interessanterweise führte die Blockierung von FcγRII und FcγRIII mithilfe des monoklonalen Anti-CD16/CD32-Antikörpers zu einer Verringerung der Phagozytose nichtopsonisierter Kryptokokken (Abb. 6a). Daher ist es möglich, dass MSR1 (das über keine eigene C-terminale Signaldomäne verfügt) Downstream-Signale auslöst, indem es die Signaldomäne von gemeinsam geclusterten FcRs nutzt.

Tlr4−/− Makrophagen wurden mit Inhibitoren von a FcγRs (n = 3 pro Zustand), b SYK und PI3K (Kontrolle, n = 6; Behandlung, n = 3) und c Mitogen Activate Protein Kinases (MAPKs) vorbehandelt ( n = 3 pro Zustand) für 1 Stunde, dann mit nicht opsonisiertem C. neoformans infiziert. Die Anzahl internalisierter Pilze pro 100 Makrophagen wurde anhand von Bildern eines Fluoreszenzmikroskops quantifiziert. Die Zahlen sind repräsentativ für drei unabhängige Experimente. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA mit Tukeys Post-hoc-Test durchgeführt. P-Werte werden über jedem Diagramm angezeigt. d Wildtyp- und Tlr4-/−-iBMDMs wurden 24 Stunden lang MAPK-Inhibitoren ausgesetzt, dann wurde die Zelloberflächenexpression von MSR1 mithilfe des Anti-Maus-CD204-PE-Antikörpers nachgewiesen. Als Isotypkontrolle wurde PE-markiertes Ratten-IgG2a κ verwendet. Die Rezeptorexpression wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen und mit der FlowJo-Software analysiert. Die Daten sind repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Prozentangaben beziehen sich auf den Prozentsatz der MSR1-positiven Zellen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Auf die Bindung von FcγRs folgt die Phosphorylierung ihrer ITAM-Motive40, gefolgt von der Rekrutierung und Aktivierung von SYK. Stromabwärts von SYK befindet sich die Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K), ein lipidmodifizierendes Enzym, das die Umwandlung von PtdIns(4,5)P2 in PtdIns(3,4,5)P3 in der Plasmamembran katalysiert41. Dies führt letztendlich zu einer Reihe biologischer Reaktionen, einschließlich der Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts, um die Phagozytose voranzutreiben40,41. Angesichts der mutmaßlichen Beteiligung von FcRs an der MSR1-vermittelten Aufnahme testeten wir als nächstes die Beteiligung dieser Downstream-Kinasen an der MSR1-vermittelten nicht-opsonischen Phagozytose. Wir fanden heraus, dass die Hemmung von SYK durch Piceatannol oder von PI3K durch Wortmannin zu einer dosisabhängigen Abnahme der Phagozytose von Kryptokokken durch Makrophagen führte (Abb. 6b). Dies impliziert ein Modell, bei dem die Bindung von C. neoformans an MSR1 die Bildung eines Signalkomplexes mit FcγRs auslöst. Die ITAM-Domäne von FcγRs ermöglicht die Aktivierung von SYK und PI3K, die dann den Aktin-Remodelling und die Internalisierung durch Pilze vorantreibt (Abb. 7).

TLR4 moduliert die Oberflächenexpression von MSR1 durch einen noch zu identifizierenden Mechanismus, sodass der Verlust der TLR4-Signalübertragung zu einer erhöhten Oberflächenexpression von MSR1 führt. Dies kann durch Modulation der MSR1-Genexpression oder durch Modulation des intrazellulären Transports des MSR1-Reservoirs zur Plasmamembran erfolgen. MSR1 ist dann für die direkte Bindung und Internalisierung von C. neoformans verantwortlich. Die MSR1-vermittelte Aufnahme beruht möglicherweise auf der Bildung eines Signalkomplexes mit FcγRII/III. Die ITAM-Domäne von FcγRs ermöglicht die Aktivierung von SYK und PI3K, die dann Rac-GTPasen aktiviert, die die Aktinpolymerisation und Phagozytose vorantreiben. Gleichzeitig können TLR3, MyD88 und TRIF auch als Korezeptoren oder Adapterproteine ​​dienen, die zur Aktivierung von ERK1/2 und p38 führen, was ebenfalls den Aktin-Remodelling und die Aufnahme von Krankheitserregern vorantreibt. Abbildung erstellt mit BioRender.com.

Es wurde zuvor gezeigt, dass TLRs durch die Mitogen-aktivierte Proteinkinase p3829 ein phagozytisches Genexpressionsprogramm induzieren. Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die erhöhte Aufnahme in Tlr4-/-Makrophagen möglicherweise von der MAPK-Signalisierung abhängt. Um diese Hypothese zu testen, haben wir Makrophagen mit Inhibitoren der drei klassischen MAPKs vorbehandelt, nämlich extrazelluläre Signalkinasen (ERK1/2), p38 und c-Jun N-terminale Kinase (JNK). ERK1/2 und p38, jedoch nicht JNK, waren an der nicht-opsonischen Phagozytose beteiligt (Abb. 6c). MAPKs sind auch der SYK-Signalübertragung nachgeschaltet und haben eine Reihe von Effektorfunktionen, einschließlich der proinflammatorischen Zytokinproduktion und der Umgestaltung des Zytoskeletts42, was das vorgeschlagene Modell unterstützt, bei dem die SYK-Rekrutierung an MSR1 über ITAM-haltige Korezeptoren die Ligandeninternalisierung vorantreibt. Die Aktivierung von MAPKs wird auch durch MyD88- und TRIF-Signale43 gesteuert. Angesichts der verringerten Aufnahme nach der Hemmung von MyD88 und TRIF (Abb. 5a, b) sowie in Myd88-/-- und Trif-/--Makrophagen (Abb. 5c) würden MyD88 und TRIF in unserem Modell auch als Adapterproteine ​​für MSR1 fungieren -vermittelte Ligandeninternalisierung (Abb. 7).

Schließlich fragten wir uns, ob die MAPK-Signalisierung die MSR1-Basisexpression modulieren könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurden Wildtyp- und Tlr4-/-Makrophagen 24 Stunden lang mit MAPK-Inhibitoren behandelt, dann wurde die MSR1-Expression mittels Durchflusszytometrie gemessen. Wir fanden jedoch keinen Unterschied in der MSR1-Expression nach ERK1/2-, p38- oder JNK-Hemmung, weder bei Wildtyp- noch bei Knockout-Makrophagen (Abb. 6d).

Unsere Ergebnisse geben Einblick in die Rolle des TLR4-MSR1-Crosstalks bei der Phagozytose von nicht opsonisierten C. neoformans durch Makrophagen. Wir fanden heraus, dass der Verlust der TLR4-Signalübertragung die Phagozytose von C. neoformans unerwartet erhöhte, indem die MSR1-Expression über einen noch zu identifizierenden Mechanismus hochreguliert wurde. Mithilfe von Msr1-/-Makrophagen zeigen wir, dass MSR1 ein wichtiger phagozytischer Rezeptor für die Aufnahme von C. neoformans ist, was auch erklärt, warum andere nicht-opsonische Rezeptoren, wie der klassische Pilzrezeptor Dectin-1, eine weniger wichtige Rolle zu spielen scheinen in der Wirtsreaktion auf C. neoformans5,44. Da es immer noch Fälle einer Aufnahme in Msr1-/-Makrophagen gab, müssen insbesondere auch andere nicht-opsonische Rezeptoren eine Rolle bei der nicht-opsonischen Phagozytose von C. neoformans spielen. Solche Rezeptoren müssen noch identifiziert werden.

Scavenger-Rezeptoren sind phagozytische Rezeptoren, die auf der Plasmamembran verschiedener Immunzellen, einschließlich Makrophagen, vorkommen25. Es wurde zunächst festgestellt, dass sie modifizierte Lipoproteine ​​niedriger Dichte (LDL) binden, mittlerweile ist jedoch bekannt, dass sie eine Vielzahl von Wirts- und mikrobiellen Liganden wie apoptotische Zellen, Phospholipide, Proteoglykane, LPS und Pilz-β-Glucane erkennen25,26,27. Es wurde bereits berichtet, dass TLR4 mit MSR1 synergistisch wirkt, um die Phagozytose von gramnegativen E. coli zu fördern, während TLR2 mit MSR1 synergistisch bei der Phagozytose von grampositiven Staphylococcus aureus wirkt35. In ähnlicher Weise war MSR1 an der Phagozytose des gramnegativen Bakteriums Neisseria meningitidis beteiligt, das auch von TLR4 erkannt wird, und modulierte gleichzeitig die TLR4-vermittelte Entzündungsreaktion auf eine N. meningitidis-Infektion45. Unsere Entdeckung des TLR/MSR1-Crosstalks im Zusammenhang mit einer Pilzinfektion legt daher nahe, dass der TLR-SR-Crosstalk als Regulator der Phagozytose und Zytokinexpression ein allgemeines Phänomen der Wirt-Pathogen-Interaktionen ist.

Scavenger-Rezeptoren, einschließlich MSR1, haben sehr kurze zytoplasmatische Schwänze ohne erkennbare Signaldomänen26, daher wird angenommen, dass sie durch die Bildung eines multimolekularen Signalkomplexes wirken. Wir verwendeten Tlr4−/− iBMDM als Modell, um potenzielle Partner bei der MSR1-vermittelten Phagozytose zu identifizieren. Wir identifizierten zunächst eine Rolle von TLR3, einem endosomalen PRR, der für seine Rolle als dsRNA-Rezeptor43 bekannt ist, in diesem Prozess. Die TLR3-Hemmung dämpfte die bei Tlr4-/-Makrophagen beobachtete erhöhte Phagozytose; Die TLR3-Hemmung hatte jedoch keinen Einfluss auf die MSR1-Expression. Da es sich bei TLR3 um einen dsRNA-Rezeptor handelt, gibt es in C. neoformans keinen offensichtlichen TLR3-Liganden. Daher muss der Mechanismus, der den Beitrag von TLR3 zur Modulation der Aufnahme von C. neoformans durch Makrophagen steuert, weiter untersucht werden.

Trotz der bei MyD88-/- und Trif-/-Makrophagen beobachteten Abnahme der C. neoformans-Phagozytose stellten wir auch fest, dass MyD88- und TRIF-defiziente Makrophagen im Vergleich zu Wildtyp-Makrophagen eine erhöhte Expression von MSR1 aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die Anwesenheit von MSR1 auf der Zelloberfläche allein nicht ausreicht, um die Phagozytose voranzutreiben. Darüber hinaus zeigt es, dass die Rolle von MyD88 und TRIF bei der Phagozytose von C. neoformans nicht auf einen Einfluss auf die MSR1-Expression zurückzuführen ist. Stattdessen können sie als Adapterproteine ​​oder Aktivatoren eines anderen Partnermoleküls fungieren, das für eine erfolgreiche MSR1-vermittelte Pathogeneinschleusung erforderlich ist. Das Gleiche gilt für TLR3, da die Behandlung mit einem TLR3-Inhibitor keinen Einfluss auf die MSR1-Expression hatte, obwohl die TLR3-Hemmung zu einer verminderten Phagozytose führte.

Weitere Untersuchungen der MSR1-vermittelten Phagozytose ergaben, dass FcγRII und III möglicherweise eine Rolle bei der Zusammenarbeit mit MSR1 an der Zelloberfläche spielen. Dies steht im Einklang mit früheren Arbeiten, bei denen festgestellt wurde, dass FcγRs neben einem anderen Scavenger-Rezeptor, CD3639, agieren. Wir haben auch gezeigt, dass Kinasen stromabwärts von FcγR, wie SYK und PI3K, und Kinasen stromabwärts von TLR3, MyD88 und TRIF, wie ERK1/2 und p38, ebenfalls an der nicht-opsonischen Aufnahme beteiligt sind. Zusammenfassend schlagen wir ein Modell vor, bei dem TLR4 die Oberflächenniveaus von MSR1 moduliert. Die Modulation von Zelloberflächen-MSR1 kann auf der Ebene der TLR4-vermittelten Regulierung der MSR1-Expression erfolgen. Alternativ könnte es für TLR4 eine Rolle bei der Umverteilung des intrazellulären MSR1-Reservoirs spielen, sodass ein TLR4-Mangel den MSR1-Transport zur Plasmamembran fördert. MSR1 ist dann für die direkte Bindung und Internalisierung von C. neoformans verantwortlich. Die Erkennung von C. neoformans durch MSR1 löst die Bildung eines Signalkomplexes mit FcγRs aus. Die ITAM-Domäne von FcγRs ermöglicht die Aktivierung von SYK und PI3K, die dann den Aktin-Remodelling und die Internalisierung durch Pilze vorantreibt. Gleichzeitig können TLRs über MyD88 und TRIF signalisieren, ERK1/2 und p38 zu aktivieren, was ebenfalls den Aktin-Remodelling und die Aufnahme von Krankheitserregern vorantreibt.

Obwohl wir die Signalübertragung von MSR1 über Korezeptoren erforschen, können wir die Möglichkeit einer direkten Signalübertragung von MSR1 über seinen zytoplasmatischen Schwanz nicht ausschließen. Menschliches MSR1 hat einen 50 Aminosäuren langen zytoplasmatischen Schwanz (55 Aminosäuren lang bei Mäusen). Die In-silico-Analyse der MSR1-Proteinsequenz zeigt das Vorhandensein eines konservierten Serinrests bei Menschen und Mäusen (Serin 27 beim Menschen und Serin 32 bei Mäusen), der gemäß UniProt46 phosphoryliert werden kann, was auf eine nachgeschaltete Phosphorylierungskaskade schließen lässt. Tatsächlich wurde gezeigt, dass eine direkte Verbindung zwischen MSR1 und Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase erforderlich ist, um die Aufnahme apoptotischer Zellen durch Makrophagen voranzutreiben47. In ähnlicher Weise wurde Lyn-Tyrosinkinase während der Aufnahme von acetyliertem LDL48 gemeinsam mit MSR1 immunpräzipitiert, was die Möglichkeit einer direkten MSR1-vermittelten Signalübertragung unterstützt.

Der Mechanismus der TLR4-vermittelten Regulation der MSR1-Expression bleibt unklar. Wir haben die MSR1-Expression nach Exposition gegenüber TLR3- und MAPK-Inhibitoren sowie in MyD88–/–- und Trif–/–-Makrophagen gemessen. Keiner dieser Signalwege hatte irgendeinen Einfluss auf die MSR1-Expression, obwohl sie eine Rolle bei der Phagozytose spielten. Daher kann der Mechanismus des TLR4/MSR1-Übersprechens zur Modulation der Phagozytose unabhängig von dem Mechanismus sein, der die MSR1-Expression steuert. Insbesondere wurde gezeigt, dass ERK1/2 die LPS-induzierte MSR1-Expression49 moduliert, nicht jedoch die CD36-Expression50. Darüber hinaus modulierte die JAK-STAT-Signalisierung die MSR1- und CD36-Expression nach LPS-Stimulation. Wir sahen in unserer Studie keine Rolle für ERK1/2 bei der Modulation der MSR1-Expression, wahrscheinlich weil wir in unserem Versuchsdesign keine LPS-Stimulation verwendeten. In Zukunft wird es interessant sein, den Mechanismus der MSR1-Expression zu Studienbeginn ohne LPS-Stimulation zu untersuchen, möglicherweise durch einen Omics-basierten Ansatz.

Andere haben die Rolle von TLR4 während der Wirtsreaktion auf eine Cryptococcus-Infektion untersucht; Diese Studien haben jedoch widersprüchliche Ergebnisse erbracht9,32,51,52. Eine In-vitro-Studie ergab, dass die Stimulation von Mikrogliazellen, die aus dem Gehirn von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, mit dem TLR4-Agonisten Lipopolysaccharid (LPS) in MyD88-abhängiger Weise zu einer erhöhten Phagozytose und Abtötung von C. neoformans führte53. Interessanterweise haben In-vivo-Studien mit TLR4-defizienten Mäusen ergeben, dass der Rezeptor während der Reaktion des Wirts auf eine Infektion entbehrlich ist32,33,51. MyD88 ist ein wichtiges Adaptermolekül stromabwärts aller TLRs außer TLR3. Mäuse, denen MyD88 fehlt, zeigen durchweg, dass dieses Adaptermolekül eine wichtige Rolle bei der Anti-Cryptococcus-Immunantwort spielt33,51, wodurch die vorgeschalteten TLRs an der Wirtsreaktion beteiligt sind. Allerdings ist die genaue Rolle einzelner TLRs, einschließlich TLR4, bei einer Kryptokokkeninfektion bislang kaum verstanden. Unsere Daten legen nahe, dass eine mögliche Erklärung für diese früheren widersprüchlichen Ergebnisse das unterschiedliche Ausmaß der MSR1-Expression ist, das in diesen Studien nicht berücksichtigt wurde. Hier zeigen wir, dass der Knockout von TLR4 die MSR1-Expression erhöhte; Andere haben jedoch gezeigt, dass die LPS-vermittelte Stimulation von TLR4 auch in der Lage war, die Expression von Scavenger-Rezeptoren zu erhöhen, was zu einer erhöhten Aufnahme führte29,49. Obwohl erwartet wird, dass ein TLR4-Mangel und eine Vorbehandlung mit einem TLR4-Agonisten gegensätzliche Auswirkungen haben, deuten unsere Daten darauf hin, dass jede Störung der TLR4-Signalisierung die Scavenger-Rezeptor-Expression beeinflusst, was sich auf die Reaktion der Makrophagen auf eine Infektion auswirken könnte.

Eine In-vivo-Studie mit Msr1-/-Mäusen ergab, dass Knockout-Mäuse eine geringere Lungenpilzbelastung und eine verminderte Expression von T-Helfer-2-Zytokinen (Th2) aufwiesen, einem Immunpolarisationszustand, der das Wachstum und die Verbreitung von Pilzen fördert13. Daher kamen die Autoren zu dem Schluss, dass MSR1 normalerweise von C. neoformans gekapert wird, um seine Pathogenese zu fördern. Wenn dies der Fall ist, könnte die erhöhte Expression von MSR1, die wir in Tlr4-/-Makrophagen beobachten, mit schlechten Krankheitsausgängen korrelieren. Diese Idee wird durch den Befund gestützt, dass klinische Isolate von C. neoformans, die leichter phagozytiert werden können, eine erhöhte Pilzbelastung im Gehirn, eine verringerte Überlebensrate der Mäuse und eine Polarisierung in Richtung der nicht schützenden Th2-Reaktion aufwiesen54. In ähnlicher Weise waren klinische Isolate mit niedrigen Phagozytoseindizes mit einer schlechten Pilzclearance (selbst bei antimykotischer Behandlung) in der Liquor cerebrospinalis verbunden55. Unterdessen waren Isolate mit hohen Phagozytoseindizes mit einer erhöhten Mortalität verbunden55,56. Daher sind sowohl eine sehr hohe als auch eine sehr niedrige Phagozytose Prädiktoren für einen schlechten Krankheitsverlauf, was auf die Existenz eines „Goldlöckchen“-Niveaus bei der Aufnahme schließen lässt. Letztendlich könnten sich Strategien zur Manipulation der nicht-opsonischen Aufnahme von Kryptokokken (vielleicht mit blockierenden Inhibitoren oder (Ant-)Agonisten des Aufnahmewegs) als nützlicher therapeutischer Ansatz erweisen, um bei Patienten dieses „Goldlöckchen“-Niveau zu erreichen, obwohl die Aufnahme nicht durch gesteuert wird Bei MSR1 allein müssen wir den Beitrag anderer nicht-opsonischer PRRs und mögliches Crosstalk zwischen Rezeptoren berücksichtigen. Darüber hinaus könnte es auch relevant sein, die Auswirkung von MSR1-Polymorphismen auf die Anfälligkeit für Kryptokokken-Meningitis zu untersuchen.

Zusammenfassend stellen wir hier die Bedeutung des TLR4/MSR1-Crosstalks bei der Phagozytose von nicht-opsonisierten C. neoformans vor, identifizieren MSR1 als kritischen Rezeptor für die nicht-opsonisierte Phagozytose von C. neoformans und schlagen einen Mechanismus vor, bei dem MSR1 durch Ligandenbindung interagiert mit Korezeptoren wie FcγRs, um die nachgeschaltete Signalübertragung auszulösen.

Die für diese Studie verwendeten Leukozytenkegel wurden mit ethischer Genehmigung des Ethikausschusses für Wissenschaft, Technologie, Ingenieurwesen und Mathematik der Universität Birmingham erhalten (Genehmigungsreferenz ERN15_0804c). Vor der Blutspende wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Alle Proben wurden nach dem Experiment vollständig anonymisiert und vernichtet.

Die J774A.1-Zelllinie [ECACC] wurde in T-75-Kolben [Fisher Scientific] in Dulbeccos Modified Eagle-Medium mit niedrigem Glucosegehalt (DMEM) [Sigma-Aldrich], das 10 % lebendes fötales Rinderserum (FBS) enthielt [Sigma-Aldrich], kultiviert. Aldrich], 2 mM L-Glutamin [Sigma-Aldrich] und 1 % Penicillin- und Streptomycin-Lösung [Sigma-Aldrich] bei 37 °C und 5 % CO2. Während der Phagozytosetests wurden J774A.1-Makrophagen in einer Dichte von 1 × 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte [Greiner Bio-One] ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Immortalisierte aus dem Knochenmark stammende Makrophagen wurden ursprünglich aus C57BL/6-Wildtyp-, Tlr4−/−-, MyD88−/−- und Trif−/−-Single-Knockout-Mäusen isoliert und durch Transformation mit Retroviren, die Raf und Myc, zwei bekannte Protoviren, exprimieren, immortalisiert -Onkogene57,58,59. Immortalisierte BMDMs wurden in DMEM, niedrigem Glucosegehalt [Sigma-Aldrich], ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS [Sigma-Aldrich], 2 mM L-Glutamin [Sigma-Aldrich] und 1 % Penicillin- und Streptomycinlösung [Sigma-Aldrich], kultiviert ] bei 37 °C und 5 % CO2. Während der Phagozytosetests wurden iBMDMs 24 Stunden vor der Infektion mit einer Dichte von 3 × 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte [Greiner Bio-One] ausgesät. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert.

Zellen des Max-Planck-Instituts (MPI) sind eine nicht transformierte, vom Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) abhängige Maus-Makrophagen-Zelllinie, die funktionell den Alveolarmakrophagen ähnelt30,60. In dieser Studie wurden MPI-Zellen von Wildtyp-Msr1-/-Makrophagenrezeptor-Mäusen mit Kollagenstruktur-Knockout (Marco-/-) und MSR1/MARCO-Doppel-Knockout (DKO) C57BL/6-Mäusen verwendet. Die Zellen wurden in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-Medium [ThermoFisher] kultiviert, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem FBS [Sigma-Aldrich], 2 mM L-Glutamin [Sigma-Aldrich] und 1 % Penicillin- und Streptomycin-Lösung [Sigma -Aldrich] bei 37 °C und 5 % CO2. Jeder Kolben wurde außerdem mit 1 % Vol./Vol. GM-CSF-konditioniertem RPMI-Medium ergänzt, das unter Verwendung der X-63-GMCSF-Zelllinie hergestellt wurde. Bei der Verwendung in Phagozytosetests wurden MPI-Zellen in einer Dichte von 2 × 105 Zellen pro Vertiefung einer 24-Well-Platte [Greiner Bio-One] mit 1 % Vol./Vol. GM-CSF ausgesät. Anschließend wurden die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Alle in dieser Forschung verwendeten Zelllinien sind im Handel oder über die Autoren erhältlich.

Leukozytenkegel von gesunden Spendern wurden vom National Health Service Blood Transfusion Service (NHSBT) bezogen und innerhalb von 4 Stunden umgehend verarbeitet. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus den Zapfen mithilfe einer standardmäßigen Dichtegradientenzentrifugationsmethode isoliert. Nach einer DPBS-Waschung wurde das Blut mit einem gleichen Volumen DPBS (mit 2 % FBS) gemischt und vorsichtig auf Lymphoprep (StemCell) geschichtet. Die Zentrifugation erfolgte bei 1100 × g für 20 Minuten ohne Betätigung der Bremsen. Die resultierende weiße Leukozytenschicht wurde gesammelt und durch 10-minütiges Zentrifugieren bei 300 × g weiter mit DPBS gewaschen. Rote Blutkörperchen (RBC) wurden unter Verwendung einer RBC-Lyselösung (BioLegend) für 10 Minuten bei Raumtemperatur entfernt. Anschließend wurden CD14+-Monozyten mittels immunomagnetischer positiver Selektion (Miltenyi Biotec) aus den PBMCs isoliert. Die isolierten menschlichen Monozyten wurden mit einer Dichte von 0,5 × 106 Zellen pro Vertiefung in mit Gewebekultur behandelten Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät und in vollständigem RPMI 1640-Medium, ergänzt mit 10 % menschlichem Serum und 20 ng/ml menschlichem GM-CSF (PeproTech), kultiviert. zur Makrophagendifferenzierung. Die Zellen wurden 6 Tage lang inkubiert, mit einem Mediumaustausch am 3. Tag.

Es wurden Phagozytosetests durchgeführt, um die Aufnahme von Cryptococcus durch Makrophagen unter verschiedenen Bedingungen zu messen. 24 Stunden vor Beginn des Phagozytosetests wird eine Übernachtkultur von Cryptococcus neoformans var. Der Stamm grubii KN99α, der zuvor biolistisch transformiert worden war, um grün fluoreszierendes Protein (GFP)61 zu exprimieren, wurde durch Pflücken einer Pilzkolonie aus YPD-Agarplatten (50 g/l YPD-Brühenpulver [Sigma-Aldrich], 2 % Agar [ MP Biomedical]) und Resuspendieren in 3 ml flüssiger YPD-Brühe (50 g/L YPD-Brühepulver [Sigma-Aldrich]). Anschließend wurde die Kultur über Nacht bei 25 °C unter konstanter Rotation (20 U/min) inkubiert.

Am Tag des Tests wurden Makrophagen mit 150 ng/ml Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) [Sigma-Aldrich] 1 Stunde lang bei 37 °C aktiviert. Die PMA-Stimulation wurde in Medien mit hitzeinaktiviertem Serum (iBMDMs und MPI-Zellen) oder in serumfreien Medien (J774A.1) durchgeführt, um den Beitrag von Komplementproteinen während der Phagozytose zu eliminieren. Bei der Verwendung von aus menschlichen Monozyten abgeleiteten Makrophagen (HMDMs) wurde den M0-Makrophagen 2 Stunden lang das Serum entzogen. Gegebenenfalls wurden Makrophagen dann mit der gewünschten Konzentration an löslichen PRR-Inhibitoren (Supplementary Data 1) behandelt und 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. In der Zwischenzeit erfolgte eine 30-minütige Vorbehandlung mit dem allgemeinen Scavenger-Rezeptorliganden, oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (ox-LDL). Die für jedes Molekül verwendete Konzentration ist in den Zusatzdaten 1 und in den entsprechenden Ergebnissen angegeben.

Um C. neoformans auf eine Infektion vorzubereiten, wurde die C. neoformans-Übernachtkultur zweimal in 1X PBS gewaschen und 2,5 Minuten bei 6500 U/min zentrifugiert. Um Makrophagen mit nicht opsonisierten C. neoformans zu infizieren, wurde das C. neoformans-Pellet nach der letzten Wäsche in 1 ml PBS resuspendiert, mit einem Hämacytometer gezählt und die Pilze mit Makrophagen bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 10:1 inkubiert . Die Infektion konnte 2 Stunden lang bei 37 °C und 5 % CO2 stattfinden. Die Infektion erfolgte in Gegenwart löslicher Inhibitoren.

In einigen Fällen wurden Makrophagen mit Antikörper-opsonisierten C. neoformans infiziert. Um die Pilze zu opsonisieren, wurden 1 × 106 Hefezellen in 100 μl PBS 1 Stunde lang mit 10 μg/ml antikapsulärem 18B7-Antikörper (ein freundliches Geschenk von Arturo Casadevall, Johns Hopkins University, Baltimore, USA) opsonisiert. Nach einer zweistündigen Infektion wurden die Makrophagen viermal mit PBS gewaschen, um so viel extrazellulären C. neoformans wie möglich zu entfernen.

Nach dem Abwaschen extrazellulärer Kryptokokken wurde die Anzahl der phagozytierten Pilze anhand von Bildern eines Fluoreszenzmikroskops quantifiziert. Um zwischen phagozytiertem und extrazellulärem C. neoformans zu unterscheiden, wurden die Vertiefungen 10 Minuten lang mit 10 μg/ml Calcofluor White (CFW) [Sigma-Aldrich], einem Fluorochrom, das Cellulose und Chitin in Zellwänden von Pilzen, Parasiten und Pflanzen erkennt62, behandelt 37 °C. Als nächstes wurden Fluoreszenzmikroskopiebilder mit dem Zeiss Axio Observer [Zeiss Microscopy] aufgenommen, der mit der Kamera ORCA-Flash4.0 C11440 [Hamamatsu] bei 20-facher Vergrößerung ausgestattet war. Es wurden das Phasenkontrastobjektiv, der EGFP-Kanal und der CFW-Kanal verwendet. Die Bildaufnahme wurde mit der ZEN 3.1 Blue-Software [Zeiss Microscopy] durchgeführt und die resultierenden Bilder wurden mit der Fiji-Bildverarbeitungssoftware [ImageJ] analysiert.

Um die Anzahl der phagozytierten Kryptokokken zu quantifizieren, wurde die Gesamtzahl der aufgenommenen C. neoformans in 200 Makrophagen gezählt und die Werte dann auf die folgende Gleichung angewendet: ((Anzahl der phagozytierten C. neoformans/Anzahl der Makrophagen) * 100). Daher wird das Ergebnis des Phagozytosetests als Anzahl der internalisierten Pilze pro 100 Makrophagen dargestellt.

Um die intrazelluläre Proliferationsrate (IPR) von C. neoformans innerhalb von Makrophagen zu bestimmen, wurden infizierte Makrophagen in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum eingefangen. Die Bildgebung lebender Zellen wurde durchgeführt, indem der Phagozytosetest wie üblich durchgeführt wurde. Nach dem Abwaschen extrazellulärer Kryptokokken wurde das entsprechende Medium für die Makrophagenzelllinie vor der Bildgebung wieder in die Vertiefung gegeben. Die Live-Bildgebung erfolgte mit dem Zeiss Axio Observer bei 20-facher Vergrößerung und die Bilder wurden 18 Stunden lang alle 5 Minuten bei 37 °C und 5 % CO2 aufgenommen.

Die resultierenden Videos wurden mit Fiji [ImageJ] analysiert und der IPR wurde durch Quantifizierung der Gesamtzahl der internalisierten Pilze in 200 Makrophagen im „ersten Frame“ (Zeitpunkt 0 (T0)) und im „letzten Frame“ (T10) bestimmt. Dann wurde die Anzahl der phagozytierten Pilze bei T10 durch die Anzahl der phagozytierten Pilze bei T0 dividiert, um den IPR zu erhalten (IPR = T10/T0).

Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde die Rezeptorlokalisation auf Makrophagen untersucht. Zunächst wurden 13-mm-Deckgläser auf 24-Well-Platten gelegt, bevor mit der gewünschten Anzahl an Makrophagen gesät wurde. Nach der Inkubation über Nacht wurden Makrophagen in einem Standard-Phagozytosetest verwendet. Vor der Färbung wurden Makrophagen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und mit 0,1 % Triton X-100, verdünnt in PBS, 10 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert. Um eine unspezifische Bindung zu verhindern, wurden die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA), verdünnt in 1xPBS, inkubiert. Um die MSR1-Lokalisierung zu färben, Kaninchen-Anti-Maus-MSR1 (E4H1C) (1:100) [Cell Signaling Technology; Kat.-Nr.: 91119; Als primärer Antikörper wurde Klon E4H1C verwendet. Die Zellen wurden mit dem primären Antikörper 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Makrophagen mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG-F(ab')2-Fragment-Sekundärantikörper (1:500) [Cell Signaling Technology; Kat.-Nr.: 8889 S] für 1 Stunde bei Raumtemperatur und im Dunkeln. Deckgläser wurden mit DAPI [Vector Laboratories] auf 5 μl VECTASHIELD HardSet Antifade-Eindeckmedium montiert. Die Bilder wurden mit dem Zeiss LSM880 Confocal mit Airyscan2, den Laserlinien 405, 488, 561 und 640 nm und bei 63-facher Ölvergrößerung aufgenommen. Die Bildaufnahme wurde mit der ZEN Black 3.0-Software [Zeiss Microscopy] durchgeführt und die resultierenden Bilder wurden mit der Fiji-Bildverarbeitungssoftware [ImageJ] analysiert.

Mithilfe der Durchflusszytometrie wurde die Oberflächenexpression von Scavenger-Rezeptoren auf Makrophagen gemessen. Vor der Färbung wurden Makrophagen mit 2,5 μg/ml Ratten-Anti-Maus-CD16/CD32-Fc-Block [BD Biosciences; Kat.-Nr.: 553142; Klon 2.4G2] verdünnt in FACS-Puffer (1XPBS ohne Mg2+ und Ca2+, ergänzt mit 2 % hitzeinaktiviertem FBS und 2 mM EDTA). Nach der Fc-Blockierung wurde die gewünschte Konzentration an Fluorochrom-konjugierten Antikörpern, verdünnt in FACS-Puffer, in jedes Röhrchen gegeben, immer noch in Gegenwart der Fc-Blockmischung. Die folgenden Fluorochrom-konjugierten Antikörper wurden verwendet: 0,5 μg/ml Anti-Maus-CD45-PerCP-Cyanin5,5 [ThermoFisher; Kat.-Nr.: 45-0451-82; Klon 30-F11], 0,25 μg/100 μL Anti-Maus-CD204(MSR1)-PE [Fisher Scientific; Kat.-Nr.: 12-204-682; Klon M204PA], 0,25 μg/100 μL Anti-Maus CD36-BB515 [BD Biosciences; Kat.-Nr.: 565933; Klon CRF D-2712] und 10 μl/100 μl Anti-Maus-MARCO-Fluorescein [Biotechne; Kat.-Nr.: FAB2956F; Klon 579511]. Zur Unterstützung bei der Festlegung der Gating-Grenzen wurden fluoreszierende Minus-Eins-Kontrollen (FMO) einbezogen. Isotypkontrollen wurden verwendet, um auf unspezifische Bindung zu testen. Die folgenden Isotyp-Kontrollantikörper wurden verwendet: 0,25 μg/100 μL PE-Ratten-IgG2a, κ-Isotypkontrolle [Fisher Scientific; Kat.-Nr.: 15248769; Klon eBR2a], 0,25 μg/100 μL BB515 Maus-IgA, κ-Isotypkontrolle [BD Biosciences; Kat.-Nr.: 565095; Klon M18-254] und 10 μl/100 μl Ratten-IgG1-Fluorescein-Isotypkontrolle [Biotechne; Kat.-Nr.: IC005F; Klon IC0057]. Schließlich wurden mit nur einem Fluorophor gefärbte Proben als Kompensationskontrollen verwendet. Nach der Färbung wurden die Proben für Einzelfärbungen und ungefärbte Kontrollen in FACS-Puffer und für alle anderen Proben in FACS-Puffer mit 0,2 μg/ml DAPI [ThermoFisher], einem lebenden toten Farbstoff, resuspendiert.

Gefärbte Proben wurden auf dem Attune NxT-Durchflusszytometer [ThermoFisher] analysiert und mit der Attune NxT-Software [ThermoFisher] erfasst. Die resultierenden Daten wurden mit der Software FlowJo v10.8.1 für MacOS [BD Life Sciences] analysiert. Vor der Bestimmung des Anteils der Makrophagen, die für ein bestimmtes Fluorochrom positiv sind, wurde eine Gating-Strategie angewendet, um den sequentiellen Ausschluss von Trümmern und Dubletts zu erreichen (ergänzende Abbildung 6). Anti-CD45-PerCP-Cyanin5.5 wurde verwendet, um die Gesamtleukozytenzahl zu identifizieren, und DAPI wurde verwendet, um tote Zellen auszuschließen.

GraphPad Prism Version 9.5.0 für MacOS (GraphPad Software, San Diego, CA) wurde verwendet, um grafische Darstellungen numerischer Daten zu generieren. Inferenzstatistische Tests wurden mit Prism durchgeführt. Basierend auf den Ergebnissen eines Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität wurde angenommen, dass die Datensätze normalverteilt sind. Um die Mittelwerte zwischen den Behandlungen zu vergleichen, wurden daher die folgenden parametrischen Tests durchgeführt: ungepaarter zweiseitiger t-Test, einfaktorielle ANOVA und zweifaktorielle ANOVA. Den ANOVA-Tests folgte der Tukey-Post-hoc-Test. Die Variation zwischen den Behandlungen wurde als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert < 0,05 war.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

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Wir danken Maria Makarova für ihre Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Michael G. Tomlinson für seine In-silico-Analyse von MSR1 und seinem Beitrag zur Diskussion, Sean D. Kelly für technische Hilfe bei der Etablierung von MPI-Zelllinien und Sarah Dimeloe und Nancy Gudgeon für ihre Hilfe Ratschläge zur Kultur von PBMCs. Die MSR1-Knockout- und MSR1/MARCO-Double-Knockout-Linien wurden mit Unterstützung von NC3Rs Grant NC/V001019/1 eingerichtet. Die Arbeit im CEB-Labor wird durch den Zuschuss BB/V000276/1 unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Projektstipendium der Royal Society (RGS\R2\202260) an das SM-Labor unterstützt. CUO wird von einem Ph.D. unterstützt. Stipendium des Darwin Trust of Edinburgh. ALW wurde von Ph.D. unterstützt. Finanzierung durch das Doktorandenausbildungsprogramm „MIDAS“ des Wellcome Trust. RCM dankt dem BBSRC und dem European Research Council Consolidator Award für seine Unterstützung.

Institut für Mikrobiologie und Infektion und School of Biosciences, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, B15 2TT, Vereinigtes Königreich

Chinaemerem U. Onyishi, Guillaume E. Desanti, Alex L. Wilkinson, Samuel Lara-Reyna, Eva-Maria Frickel und Robin C. May

School of Biomedical Sciences, Fakultät für Gesundheit, University of Plymouth, Plymouth, Vereinigtes Königreich

György Fejer

Universität Paris-Saclay, INSERM, Hämostase, Entzündung, Thrombose HITH U1176, 94276, Le Kremlin-Bicêtre, Frankreich

Olivier D. Christophe

University of Cambridge, Department of Medicine, Box 157, Level 5, Addenbrooke's Hospital, Hills Road, Cambridge, CB2 0QQ, Vereinigtes Königreich

Clare E. Bryant

Peter Gorer Abteilung für Immunbiologie, School of Immunology & Microbial Sciences, King's College London, London, SE1 9RT, Vereinigtes Königreich

Subhankar Mukhopadhyay

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, College of Medicine, Chang Gung University, Taoyuan, Taiwan

Sonon Gordon

Sir William Dunn School of Pathology, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

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RCM konzipierte das Projekt. ALW und GD generierten vorläufige Daten, die in die Konzeption des Projekts einflossen. CUO und RCM erstellten Hypothesen und entwarfen die Experimente. CUO führte alle Experimente durch, analysierte die Daten und verfasste das Manuskript. GD half bei der Durchführung der Durchflusszytometrie-Experimente. SLR und EMF isolierten Monozyten aus menschlichen Leukozytenzapfen. CEB stellte Tlr4−/−, MyD88−/−, Trif−/− immortalisierte BMDMs zur Verfügung. SM, SG und GF stellten Msr1-/--, Marco-/-- und DKO-MPI-Zellen bereit. ODC stellte transfizierte Zelllinien bereit, die zur Hypothesengenerierung beitrugen. SM und SG diskutierten kritisch die experimentellen Ergebnisse. Alle Autoren haben zur Durchsicht des Manuskripts beigetragen. RCM hat die Finanzierung eingeworben.

Korrespondenz mit Robin C. May.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Julianne Djordjevic und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Onyishi, CU, Desanti, GE, Wilkinson, AL et al. Der Crosstalk zwischen Toll-like-Rezeptor 4 und Makrophagen-Scavenger-Rezeptor 1 reguliert die Phagozytose eines Pilzpathogens. Nat Commun 14, 4895 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40635-w

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Eingegangen: 27. Januar 2023

Angenommen: 03. August 2023

Veröffentlicht: 14. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40635-w

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